Characterization of gene or gene clusters responsible for the production of antimicrobial compounds in Pseudoalteromonas atlantica

Abstract

The intensive and unconscious use of antibiotics alongside with the decrease of investment in research of novel molecules (since the mid 1960s), has led to a rise of highly resistant bacteria. These microorganisms have been developing mechanisms that enable them to survive to the aggressions of classical antibiotics. Also, these self-defense mechanisms are easily transmitted between bacteria, which is a worrisome panorama. It is necessary to get back to a proactive fight against these microorganisms. Living organisms have long proven to be a rich source for antimicrobial compounds due to their need to fight for their place in ecological niches. The marine environment is known to be prolific with microbial communities and thus a great diversity of bioactive compounds was already discovered. In this thesis work, I searched for novel antimicrobial compounds in a marine bacteria, Pseudoalteromonas atlantica. A genome mining approach was followed. A search for clusters coding for secondary metabolites with antimicrobial characteristics was done using softwares such as AntiSmash, ClustScan, HHpred or BLASTx. This process resulted in the finding of 17 putative clusters coding for polyketide synthase and also 1 putative cluster coding for a bacteriocin. To assess if P. atlantica is, in fact, capable of producing antimicrobial compounds, and in the positive case, to further enhance the production of such compounds, a compound production optimization procedure was performed. Optimal culture conditions for production of antibiotic compounds in P. atlantica were met for Marine Broth culture medium at a temperature of 23ºC, a pH of 8 and a 120 rpm agitation. Bacteria-free spent media proved to inhibit the growth of Escherichia coli K12. Moreover, a bacteria-free spent media from cultures grown in the presence of a competitor (E. coli K12; Staphylococcus aureus; Pseudomonas aeruginosa or Vibrio harveyi) has also resulted in the inhibition of Salmonella enteritidis. These results indicate that the P. atlantica genome might be a source for novel antimicrobial compounds. In fact, under the described conditions, P. atlantica was capable of producing antimicrobial molecules with a narrow activity spectrum.

O uso intensivo e inconsciente de antibióticos e a quebra do investimento na investigação de novas moléculas (desde meados dos ano 60), levou ao aparecimento de bactérias altamente resistentes. Estes microorganismos têm desenvolvido mecanismos que os permite sobreviver às agressões provocadas pelos antibióticos clássicos. Além disso, estes mecanismos de auto-defesa são facilmente transmitidos entre diferentes espécies de bactérias, o que é um cenário muito preocupante. É então necessário voltar a uma atitude proactiva na luta contra estes microorganismos. Os microorganismos já há muito provaram ser uma fonte rica em compostos antimicrobianos, devido à sua necessidade de lutar por um lugar nos respectivos nichos ecológicos. O ambiente marinho é conhecido por ser fértil em comunidades microbianas e portanto uma grande diversidade de compostos bioactivos foram já descobertos. Nesta tese procurei por compostos antimicrobianos numa bactéria marinha, a Pseudoalteromonas atlantica. Seguiu-se uma estratégia de “genome mining”. Foi realizada uma procura de clusters de metabolitos secundários de cariz antimicrobiano, através do recurso a ferramentas como o AntiSmash, ClustScan, HHpred ou BLASTx. Todo este processo resultou na descoberta de 17 putativos clusters de poliquétidos sintetases e 1 putativo cluster de bacteriocina. De forma a avaliar se a P. atlantica é capaz de produzir compostos antimicrobianos, e, em caso positivo, para aumentar a produção desses compostos, foi realizado um procedimento de optimização da produção do antimicrobiano. As condições óptimas para a produção de compostos antimicrobianos em P. atlantica revelaram ser o uso de meio marinho (Marine Broth), a uma temperatura de 23ºC, um pH de 8 e uma agitação de 120 rpm. O meio de cultura gasto desprovido de bactérias provou inibir o crescimento de Escherichia coli K12. Além disso, na presença de um competidor (E. coli K12; Staphylococcus aureus; Pseudomonas aeruginosa or Vibrio harveyi), o meio de cultura de P. atlantica, também resultou na inibição de Salmonella enteritidis. Estes resultados indicam que o genoma da P. atlantica pode ser uma fonte de compostos antimicrobianos inauditos. De facto, nas condições referidas no presente trabalho, a P. atlantica foi capaz de produzir moléculas antimicrobianas, com um espectro de actividade aparentemente muito específico.