Development of bacterial cellulose membranes coated with hydroxyapatite for bone regeneration

Abstract

Bone, the major constituent of skeletal system, is susceptible to several pathological scenarios that could compromise its correct function. Advanced solutions to overcome these handicaps have always been a desire of the medical community, being guided bone regeneration (GBR) one of the approaches under development. Non-resorbable GBR membranes are mainly composed of synthetic materials. However, bacterial cellulose (BC) arises as an attractive natural origin, non-resorbable solution. In fact, this natural polysaccharide presents interesting properties for the medical field, which lead to increased research efforts into tailoring it with specific features to fit the requirements of the envisaged applications. The development of BC membranes coated with hydroxyapatite (HA) to be used both as a barrier in GBR and as a promoter of bone regeneration was the main goal of the present work. Two different types of BC, a commercial one (cBC) and in-house produced (gxBC), in three drying states, named never dried, air dried and freeze-dried, where used. BC composites (BC-HA) were prepared following a biomimetic approach involving materials pre-rehydration and chemical modification with sodium hydroxide 3M (NaOH 3M), followed by immersion in specific simulated body fluid (SBF) solutions, NaCl-free SBF and complete SBF. The influence of BC origin, drying procedures and parameters associated with the mineralization protocol were evaluated and deeper characterization was performed on a set constituted by freeze dried cBC and gxBC membranes produced with the defined and optimized protocol, namely modification with NaOH 3M for 1 min, NaCl-free SBF for 1 day and SBF for 7 days. Scanning electron microscopy (SEM) results denote that air-drying and freeze-drying promote modifications in BC microstructure, and higher porosity of gxBC freeze-dried samples, both before and after rehydration, is evident. This differentiating feature influences the mineralization of the samples, allowing internal formation of a ceramic filler, only observed on gxBC. On the other hand, in the particular case of cBC membranes, this ceramic layer is only observed on the surface of the membranes. Nevertheless, successful formation of a ceramic coating grants the effectiveness of the mineralization protocol. Elemental analysis (EDS) and x-ray diffraction (XRD) reveal the nature of this phase, identified as calcium deficient hydroxyapatite (CDHA). Material’s microstructure and the alkali treatment also influence water uptake and degradation profiles, being the highest values associated with gxBC, especially to modified samples. The effects of alkali treatment on mechanical performance were also more evident on gxBC and the presence of ceramic phase did not completely mitigate its effect. Finally, biological assays revealed promising results, with long-term cytocompatibility for all sets of BC membranes. At the end of 21 days, 3T3 and MC 3T3-E1 cells present higher metabolic active and higher viability levels when seeded in gxBC in the absence and presence of coating, respectively. Therefore, material-related and methodological variables influence both the biomimetic mineralization and final behaviour of BC membranes. The herein presented results demonstrate an effective biomimetic mineralization, with formation of CDHA phase, resulting in a final material with interesting characteristics that can be considered for GBR applications.

O osso, um dos principais constituintes do sistema esquelético, é uma estrutura suscetível a várias patologias que podem comprometer a sua função. Soluções avançadas capazes de solucionar estes problemas sempre foram um objetivo da comunidade médica, sendo a regeneração guiada de osso (RGO) uma das abordagens em desenvolvimento. As membranas não reabsorvíveis usadas em RGO são maioritariamente compostas por materiais sintéticos. Contudo, a celulose bacteriana (CB) também tem sido estudada, surgindo como uma solução atrativa, natural e não reabsorvível. De facto, este polissacarídeo de origem natural é dotado de características interessantes para a medicina, o que tem estimulado a sua investigação e interesse em adaptá-las para que melhor se enquadre na aplicação desejada. O desenvolvimento de membranas de CB revestidas com hidroxiapatite (HA) para serem usadas em RGO, tanto como membrana barreira como material promotor de regeneração óssea, é o principal objetivo deste trabalho. Neste trabalho foram usados dois tipos distintos de CB, comercial (cCB) e produzida em laboratório (gxCB), em três estados de secagem, nomeadamente nunca secas, secas ao ar e liofilizadas. Compósitos de CB (CB-HA) foram preparados seguindo uma abordagem biomimética que envolve pré-reidratação dos materiais, seguida de modificação química com hidróxido de sódio 3M (NaOH 3M) e imersão em soluções específicas que simulam os fluídos corporais, com e sem NaCl. A influência do tipo de CB, dos processos de secagem e dos parâmetros associados ao protocolo de mineralização foram avaliados. Um conjunto constituído por membranas cCB e gxCB liofilizadas e produzidas tendo em conta o protocolo de mineralização definido e otimizado, foi analisado mais profundamente. Os resultados microscopia eletrónica de varrimento (SEM) demonstram que a secagem ao ar e a liofilização promovem modificações na microestrutura da CB e revelam a maior porosidade da gxCB liofilizada, tanto depois e antes da pre-rehidratação. Esta diferença influenciou a mineralização interna das amostras, apenas observada na gxCB. Contudo, uma camada de cerâmico foi também formada na superfície da cCB, indicando a efetividade do protocolo de mineralização. A análise elementar (EDS) e a difração de raios x (XRD) revelou a natureza desta fase, nomeadamente HA com défice de cálcio. A microestrutura assim como o tratamento químico também influenciam a capacidade de inchamento e degradação das membranas, sendo que os valores mais elevados estão associados à gxCB, especialmente com as amostras modificadas. Os efeitos do tratamento alcalino na performance mecânica dos materiais também é mais evidente na gxCB, sendo que a presença da fase cerâmica não atenua completamente o seu efeito. Por último, os ensaios biológicos revelaram resultados promissores, evidenciando citocompatibilidade a longo prazo para todos os conjuntos de CB. Ao fim de 21 dias de cultura, as células 3T3 e MC 3T3-E1 apresentam maior atividade metabólica quando na presença de gxCB, com e sem recobrimento cerâmico, respetivamente. Assim sendo, variáveis relacionadas com o material e com o próprio processo influenciam tanto a mineralização biomimética como o posterior comportamento da BC. Os resultados aqui apresentados demonstram a efetividade da mineralização, resultando num material final com propriedades interessantes para RGO.