Systems analysis of metabolism in Helicobacter pylori

Abstract

Helicobacter pylori is associated with gastric diseases, such as gastritis, peptic and duodenal ulcers, mucosa associated lymphoid tissue lymphoma and gastric adenocarcinomas. Despite more than half of the global population being infected with this bacterium, not all individuals will develop clinical symptoms. Nevertheless, its association with gastric cancer, the high infection rate, as well as the failures on eradication efforts and vaccine development lead to an important health concern. In order to better understand the mechanisms leading to disease and also to develop effective ways to fight H. pylori infection, it is important to understand its physiological and metabolic behavior. H. pylori is a microaerophilic, gram negative, fastidious organism, for which no effective defined medium has been developed. Furthermore, current cultivation procedures use media that, even when semi-defined, have a variety of nutrients that can be used as carbon and energy sources. Under those conditions, the metabolic and physiological characterization of H. pylori is very difficult. The aim of this work was thus to study the physiology and metabolism of H. pylori to allow a better understanding of the behavior and pathogenicity of this organism. For that aim, a systems biology approach was used where Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS) based metabolomics and genomics data were used to characterize the nutritional requirements and the preferred carbon sources and to build a reliable metabolic model. Data on H. pylori’s exometabolome was for the first time collected from experiments performed with semi-defined media and allowed to establish the essentiality of several amino acids: L-histidine, L-leucine, L-methionine, L-valine, L-isoleucine and Lphenylalanine. Moreover, this analysis indicated that L-aspartate, L-glutamate, L-proline and L-alanine could be potential carbon sources for H. pylori. Thus, a comparative analysis of different amino and organic acids as carbon sources was performed and glutamine / glutamate emerged as the most effective compounds. However, since glutamine is unstable under the conditions used, glutamate was selected the most adequate carbon source for growing H. pylori. Then, a simplified medium containing only the essential amino acids and Lglutamate, besides vitamins and salts, as well as 5% of fetal bovine serum (FBS) was used to perform physiological studies. Under those conditions, the specific growth rate was determined to be 0.126 h-1, while the use of uniformly labeled 13C L-glutamate together with GC-MS measurements of proteinogenic amino acids allowed to confirm the essential amino acids and raise some clues about L-proline and L-alanine which, given their presence in FBS, had still unclear roles. L-proline, although not labeled, is probably not essential and could be obtained from arginine, while L-alanine showed very low labeling patterns and is hypothesized to originate from pyruvate. Finally, labeling experiments allowed to confirm the presence of a complete tricarboxylic acid cycle. These collected data, together with genomics and other information available, were used to build and validate the first genome-scale metabolic model of H. pylori that is able to make quantitative predictions, covering roughly 23% of the genome. This model can be used, in the future, to investigate novel drug targets and elucidate the metabolic basis of infection. Furthermore, a comparative study was performed that analyzed different methods for assessing growth, viability, culturability and morphology, as these are important physiological parameters.

A caracterização fenotípica é de extrema importância para entender o metabolismo celular, especialmente em organismos patogénicos, para os quais, na sua maioria, a informação disponível é limitada. Compreender o metabolismo de um organismo patogénico é fundamental para desvendar os mecanismos de interação patogénio-hospedeiro, com vista à identificação de alvos para desenvolvimento de fármacos. Neste trabalho estudou-se o metabolismo da bactéria Helicobacter pylori, um micro-organismo patogénico associado a doenças gástricas, usando uma estratégia de Biologia de Sistemas. As experiências realizadas usando um meio liquido semi-definido para crescer H. pylori provaram a existência de um fator de stress associado a uma paragem do seu crescimento, acompanhada de uma mudança de morfologia. Sendo conhecido o caracter pleiomórfico da H. pylori quando sujeita a determinadas condições de stress, e dado que os requisitos nutricionais não se encontravam completamente definidos, foi levantada a hipótese deste fator de stress estar associado à falta de um nutriente essencial. Assim, foi efetuada uma análise de exometaboloma com vista a determinar os seus requisitos nutricionais e preferências. Verificou-se a existência de aminoácidos essenciais ao crescimento, e comprovou-se a preferência dos aminoácidos como fonte de carbono (glutamato, prolina, alanina e aspartato). No entanto, algumas dúvidas persistiram relativamente à essencialidade de prolina e alanina. Para identificar a fonte de carbono preferencial foram testados diversos aminoácidos. Identificou-se que o aminoácido L-glutamato é o mais indicado ao crescimento de H. pylori, tendo-se efetuado a caracterização do seu crescimento com o referido aminoácido como fonte de carbono. Como forma de comprovar a efetiva utilização de L-glutamato como fonte de carbono, foram efetuadas experiências com 13C L-glutamato, tendo-se utilizado cromatografia gasosa com espectroscopia de massas para a análise das amostras. A análise dos aminoácidos do hidrolisado de biomassa de H. pylori permitiu comprovar a utilização de L-glutamato como fonte de carbono. Comprovou-se ainda a essencialidade dos aminoácidos isoleucina, histidina, leucina, metionina, fenilalanina e valina. Foi possível também identificar algumas vias metabólicas ativas para as quais residiam dúvidas, como o caso da existência do ciclo de Krebs completo. As experiências realizadas permitiram ainda levantar hipóteses acerca da biossíntese de L-prolina e L-alanina em H. pylori a partir de L-arginina e piruvato, respetivamente. Com a informação recolhida, associada à anotação do genoma recentemente efetuada foi possível reconstruir um modelo metabólico à escala genómica para H. pylori 26695. As previsões obtidas com o referido modelo estão de acordo com os dados experimentais. Este modelo contém informação biológica relevante para este organismo, com possível aplicação na identificação de potenciais alvos metabólicos, para a obtenção de fármacos mais efetivos na erradicação de H. pylori.