High-throughput combinatorial analysis of three-dimensional biomaterials behavior using superhydrophobic patterned platforms

Abstract

One of the still unaccomplished struggles in the maintenance of population life quality is related to the current need for effective biomaterials. The optimization of tissue engineering (TE) strategies by combining biomaterials, cells and soluble factors usually relies on time-consuming iterative processes. Rapid and low-cost high-throughput testing is needed to accelerate the discovery of ideal TE systems. The main hypothesis of this thesis was that superhydrophobic surfaces patterned with wettable spots were amenable to be used as platforms for high-throughput complete testing of 3D biomaterials. Indeed, such platforms allowed taking advantage of wettability contrast to pattern biomaterials with precise shape and pre-determined height, by controlling the volume dispensed in each spot. The superhydrophobic chips were first used to pattern ionic alginate-based cell-laden hydrogels in the wettable spots. The chemical composition of each biomaterial was evaluated by FTIR and the cellular response of fibroblast and osteoblast-like cell lines was assessed on-chip by image-based analysis. Image-based non-destructive assessment was validated by comparison with conventional biochemical colorimetric tests. Superhydrophobic chips were later used to produce and study miniaturized porous scaffolds. The size of the spots in the milimetric range allowed having porous biomaterial structures with significant pore size for cell migration and growth. Chitosan/alginate scaffolds were processed by polyelectrolyte complexation and freeze-drying, followed by fibronectin adsorption. Cell number and viability were assessed using two cell lines. DMA and μCT techniques were adapted to be used on-chip, in dry conditions, to characterize the scaffolds mechanically and morphologically. The on-chip DMA method was upgraded to be performed under physiological-like conditions using chitosan/bioactive glass nanoparticles hydrogels. The selective adhesion and proliferation of a pre-osteoblast cell line allowed hit-spotting favorable in vitro biomaterial formulations. After demonstrating their adequacy for in vitro cell-3D biomaterials interactions assessment, superhydrophobic chips containing 36 biomaterials were implanted in single Wistar rats, allowing the high-throughput in vivo study of inflammatory response caused by biomaterials. An important aspect in TE is the dependency of tissue regeneration on prolonged action of bioactive agents. Superhydrophobic chips were imprinted with ring-shaped spots with concentric superhydrophobic regions where polymeric protein-loaded spheres were deposited. The acquisition of sequential images of each spot over time using microscopy methods allowed monitoring protein release. Finally, cell suspension droplets were fixed in the wettable regions of the chips to produce cell spheroids/microtissues for drug screening by the hanging drop methodology in a robot-free automated manner. In conclusion, the superhydrophobic platforms patterned with wettable spots used in this thesis proved to be compatible with a complete study of 3D biomaterials-cells interactions, comprising a wide set of factors as biomaterials characterization, in vitro testing, innovative in vivo assessment and bioactive molecules-related tests.

Um dos desafios correntes para a manutenção da qualidade de vida das populações prende-se com a falta de biomateriais eficazes. A otimização de estratégias em engenharia de tecidos (ET) através da combinação de biomateriais, células e fatores solúveis requer, em geral, processos iterativos. Testes expeditos e de baixo custo são necessários para acelerar a descoberta de sistemas de ET ideiais. A hipótese desta tese consiste na possibilidade do uso de superfícies superhidrofóbicas padronizadas com regiões hidrofílicas como plataformas para a análise expedita e completa de biomateriais 3D. As plataformas permitiram usar o contraste de molhabilidade para depositar biomateriais com forma e altura precisas, controlando o volume colocado em cada região hidrofílica. As plataformas foram usadas para dispensar hidrogéis de alginato com células encapsuladas nas regiões molháveis. A composição química de cada biomaterial foi avaliada por FTIR, e a resposta celular foi testada através de análises de imagem, efetuadas no chip. As análises não destrutivas baseadas em imagem foram validadas por comparação com teses bioquímicos colorimétricos. As plataformas foram depois adaptadas para a produção e caracterização de estruturas porosas miniaturizadas. A dimensão milimétrica das regiões molháveis permitiu processar estruturas com poros de tamanho representativo para migração e crescimento celulares. As estruturas porosas de quitosano/alginato foram preparadas por complexação de polielectrólitos/liofilização, seguidas de adsorção de fibronectina. O número e viabilidade celulares foram estudados. As técnicas de DMA e μCT foram adaptadas para uso nos chips, em condições secas, para caracterização mecânica e morfológica. O método de DMA realizado no chip foi melhorado de forma a permitir uma análise em condições semelhantes às fisiológicas, usando hidrogéis de quitosano/nanopartículas de vidro bioactivo. A adesão selectiva e proliferação de uma linha celular de pré-osteoblastos permitiu selecionar as formulações de biomateriais mais favoráveis. Após demonstrar a sua adequabilidade para testes in vitro, implantaram-se plataformas superhidrofóbicas contendo 36 biomateriais em ratos Wistar, mostrando a sua utilidade para testes expeditos executados in vivo,para estudo da resposta inflamatória causada por biomateriais. Outro aspeto importante em ET é a dependência da regeneração de tecidos na ação prolongada de agentes bioactivos. Regiões molháveis com uma região superhidrofóbica concêntrica foram usadas para depositar esferas poliméricas contendo proteína. A aquisição sequencial de imagens por microscopia permitiu monitorizar a libertação de proteína. Finalmente, fixaram-se gotas de suspensão celular nas regiões hidrofílicas para produzir esferóides celulares para a análise de fármacos pelo método da gota suspensa. Em conclusão, as superficies superhidrofóbicas padronizadas com regiões molháveis usadas nesta tese provaram ser compatíveis com um estudo completo de interações entre células e biomateriais 3D, compreendendo um vasto conjunto de fatores, como caracterização dos biomateriais, testes in vitro e in vivo, e testes relacionados com moléculas bioactivas.