Pharmaceutical and industrial protein formulations

Abstract

Proteins are building blocks in living organisms. They possess multiple binding sites and therefore high loading capacity for all classe of chemical compounds. They can carry biological active substances and they are particularly suitable for production of nano-formulations. The aim of this PhD project is to exploit protein-based templates through emulsification methodologies. Various possibilities were studied for surface modification on those emulsions to reach higher stabilization and transdermal perfusion. The assembly of bovine serum albumin (BSA) with other proteins for micro/nanoemulsions production was explored in chapter III. Proteinaceous of laccase combined with BSA form together micro-emulsions walls with spherical and regular surface (250 nm mean diameter). This leads to high protein stabilization under high temperatures and in the presence of ultrasound fields. Microemulsions of laccase presented double half-life time when compared with the free form, which leaded to higher effectiveness on textile bleaching processes. Proteins designed for industrial applications have to be adapted to environment requirements and should be formulated to maintain the tertiary structure integrity and preserve their catalytic efficiency. High molecular weight and hydrophilicity render proteins difficulties to permeate into skin barrier and cells. In chapter IV a new methodology based on solid-in-oil (S/O) nanodispersions, for high molecular weight proteins, that transdermally cross the skin barrier was developed. For the first time, it was possible to demonstrate a successful permeation profile of a large protein, BSA (Mw=66 kDa), using a nanoemulsion of 160 nm mean diameter. This result was experimentally demonstrated by in vitro and molecular dynamics simulations. In chapter V a novel transdermal nanoformulation of hyaluronic acid (HA) conjugated with BSA in the form of S/O dispersion (129.7 nm mean diameter) was explored. Ex vivo skin permeation profile analysis revealed their great ability to cross the stratum corneum and penetrate into the dermis. No significant toxicity was found in fibroblast and keratinocyte cells. The feasibility of this nanoformulation to cross the skin barrier served as the basis for further investigation, on chapter VI, using a protease inhibitor peptide instead of BSA. The conjugation of peptide with HA suppresses the activation of metalloproteinase MMP-1, suggesting that the integrity and elastic properties of the skin could be maintained. Additionally, an enhancement in density of actin cytoskeleton filaments of dermal fibroblasts was achieved, which contribute positively to maintain the mechanical properties of the skin. These results emphasize the immense potential of the peptide/HA formulation to be applied on a pharma/cosmetic composition product, specially designed for anti-ageing applications.

As proteínas são blocos de construção em organismos vivos. Possuem múltiplos sítios ativos de ligação e portanto elevada capacidade de transporte para toda a classe de compostos químicos. Podem transportar substâncias biologicamente ativas e são particularmente adequadas para a produção de nano-formulações. Este projeto de Doutoramento tem como objetivo a pesquisa de formulações à base de proteínas através de métodos de emulsificação. Foram estudadas várias possibilidades de modificação dessas emulsões para uma maior estabilização e perfusão transdérmica. A associação de albumina de soro bovina (BSA) a outras proteínas para a produção de micro/nanoemulsões é desenvolvida no capítulo III. A sequência proteica da lacase combinada com BSA forma paredes de microemulsões de superfície esférica e regular (250 nm média de diâmetro). Este fato conduz a uma maior estabilização da proteína sob temperaturas altas e ultrassons. As microemulsoes de lacase apresentaram o dobro do tempo meia-vida em comparação com a forma livre, o que conduz a uma maior eficácia para fins de branqueamento têxtil. As proteínas desenvolvidas para aplicações industriais têm de se adaptadar às condições ambientais, devendo a sua formulação permitir manter a integridade da estrutura terciária, de forma a preservar a sua eficácia catalítica. O alto peso molecular e hidrofilicidade dificultam a penetração das proteínas na barreira da pele e nas células. No capítulo IV é desenvolvido um método novo, baseado na nanodispersão de sólido em óleo (S/O), para uma proteína de alto peso molecular que atravessa a barreira da pele por via transdérmica. Pela primeira vez, foi possível demonstrar um perfil de penetração bem sucedido de uma proteína de elevado peso molecular, BSA (66 kDa), utilizando uma nanoemulsão de 160 nm. Este resultado foi demonstrado através de testes in vitro (quantitativo e qualitativo) e de simulações de dinâmica molecular. No capítulo V, é desenvolvida uma nova nanoformulação transdérmica de ácido hialurónico (HA) conjugado com BSA, sob a forma de dispersão S/O (129,7 nm média de diâmetro). A análise ex vivo do perfil de penetração na pele revelou a sua grande capacidade para atravessar o stratum corneum e penetrar até á derme. Não foi encontrada toxicidade relevante em fibroblastos e queratinócitos. A possibilidade desta nanoformulação atravessar a barreira da pele serviu de base a posterior investigação, no capítulo VI, em que a BSA foi substituída pelo péptido inibidor de protease. A conjugação do péptido com HA suprime a ativação da metaloproteinase MMP-1, sugerindo que a integridade e propriedades elásticas da pele possam ser preservadas. Além disso, obteve-se uma melhoria da densidade dos filamentos de actina do citoesqueleto dos fibroblastos da derme, a qual contribui de forma positiva para manter as propriedades mecânicas da pele. Estes resultados evidenciam o enorme potencial da formulação péptido/HA para ser aplicada num produto de composição farmacêutica/cosmética, especialmente desenvolvido para fins de anti-envelhecimento.