Biochemical and physical surface functionalization of polycaprolactone as a key mediator of osteogenic differentiation and vascularized tissue morphogenesis

Abstract

The orthopedic implants represent an ever-growing biomedical market, as the population is continuously expanding and the average life expectancy is increasing. Tissue engineering and regenerative medicine aim at opening a pathway of therapy and treatment of bone tissue loss or end stage damage. Envisioning this goal, biodegradable solutions, such as polycaprolactone (PCL), offer a number of physiological and clinical advantages over permanent implants. This work aims to determine the aptitude of PCL surface roughness and the density-specific role of fibronectin (FN) adsorbed on PCL to induce differentiation of adult stem cells towards the osteoblastic lineage. Furthermore, as the establishment of a microvascular blood supply, necessary to assure cell survival, is still identified as a major challenge for the clinical application of (bone) engineered biomaterials, the combination of physical regular surface pattern motifs of PCL and density-specific fibronectin coating was investigated to determine the biomaterial effectiveness on the morphogenesis of microvascular tissue, both in vitro and in vivo. Our findings indicate that the optimal FN density regime of ~48 ng/cm2 could consistently and significantly support higher expression of osteocommitment biomarkers, such as cuboidal cytoskeleton morphology, alkaline phosphatase (ALP) activity and collagen type 1deposition. Furthermore, it was verified that such a density can be used as relevant alternative to the potent synthetic osteogenic supplement dexamethasone (Dex), in the osteogenic commitment of stem cells in vitro. Our analysis also demonstrated the differential regulation of the osteogenic differentiation of adult stem cells (from early ALP activity to end-process mineralization) by different roughness average (Ra) along an engineered surface roughness gradient. Faster osteogenic commitment and strongest osteogenic expression was obtained at Ra ~ 2.1 – 3.1 μm. Importantly, the removal of Dex, and even the removal of all osteogenesis-inducing supplements from the cell culture medium, did not prevent the differentiation process from occurring. Indeed, the PCL Ra ~ 0.9 – 2.1 μm showed the ability to alone direct the osteogenic differentiation of the stem cells, in vitro. Finally, we showed that geometrically defined micropatterns of PCL, in association with human density-specific FN adsorption (determined from a gradient study), can induce/instruct the endothelial cells (ECs) to mature into a luminized capillary network, both in vitro and in vivo. These results cumulatively enrich our knowledge on the biochemical and physical cues which evoke osteogenic stem cell modulation and successful recapitulation of supportive microvascularization, highlighting the potential for creating effective solutions for orthopedic applications featuring a clinically relevant biodegradable material.

Implantes ortopédicos representam um mercado em permanente expansão, uma vez que a população e a esperança média de vida continuam a aumentar. A Engenharia de Tecidos e a Medicina Regenerativa propõem-se a criar uma alternativa de terapia e de recobro de tecido ósseo perdido ou danificado. Considerando este propósito, soluções biodegradáveis, tais como policaprolactona (PCL), oferecem um conjunto de vantagens clínicas e fisiológicas sobre implantes permanentes. Este trabalho tem como objectivos determinar a competência da rugosidade à superfície de PCL e de densidades específicas de fibronectina (FN) adsorvidas em PCL, na orientação da diferenciação de células estaminais adultas (MSCs) para a linhagem osteoblástica. Ademais, a combinação de superfícies regulares e fisicamente padronizadas de PCL com uma densidade específica de revestimento de FN foi investigada para determinar a eficiência do biomaterial na morfogénese de tecido microvascular, uma vez que a organização de uma estrutura que estabeleça microcirculação sanguínia, necessária à sobrevivência celular, é ainda identificada como um obstáculo à translação bem-sucedida de estratégias de engenharia de tecidos para a clínica. A nossa investigação identificou um regime óptimo de densidade de FN (~48 ng/cm2) que apoia, consistentemente e de forma significativa, a expressão aumentada de biomarcadores de compromisso com a linhagem osteoblástica, como a morfologia cuboidal do citoesqueleto, a actividade da fosfatase alcalina (ALP) e a deposição de colagénio de tipo 1. Verificou-se ainda que a adsorpção de FN pode ser usada como uma natural e relevante alternativa ao uso do potente agente sintético de osteogénese dexametasona (Dex), para a indução da linhagem osteogénica em células estaminais, in vitro. A nossa análise também revelou regulação diferencial da diferenciação osteogénica de MSCs (da fase inicial traduzida por actividade de ALP até à fase final de mineralização) por diferente rugosidade média (Ra) à superfície do PCL. Rápido e intenso compromisso com o processo de osteogénese foi obtido a Ra ~ 2.1 – 3.1 μm. Relevantemente, a remoção de Dex e, até, de todos os suplementos indutores de osteogénese do meio de cultura celular não impediu o processo de diferenciação de decorrer. De facto, a Ra ~ 0.9 – 2.1 μm em PCL mostrou capacidade de orientar, per se, a diferenciação osteogénica de células estaminais, in vitro. Finalmente, demonstramos que micropadrões físicos de PCL, em associação a uma densidade específica de FN (determinada de um estudo de gradiente), tem capacidade para induzir/instruir células endoteliais para maturação numa rede capilar com lúmen, in vitro e in vivo. Estes resultados cumulativamente enriquecem o nosso conhecimento sobre sinais físicos e bioquímicos que provocam modulação osteogénica de células estaminais, e ainda eficiente recapitulação de microvascularização de suporte, enfatizando o potencial de criação de soluções eficazes para aplicações ortopédicas usando um material biodegradável e clinicamente relevante.