Improving derived Listeria phage endolysins properties at low temperatures

Abstract

Listeria monocytogenes is a Gram-positive opportunistic pathogen that can grow in a wide variety of conditions and is responsible for listeriosis, a potential fatal disease, associated to the ingestion of contaminated food. The concerns about the upsurge of widespread reported cases, combined with emerging antibiotic-resistance amongst pathogenic bacteria, such as L. monocytogenes, demand for the development of novel preservation techniques that ensure the safety of food products. Endolysins, which originate from virulent bacteriophages, are responsible for the hydrolysis of the covalent bonds in peptidoglycan layer of the host cell. These enzyme properties represents a good alternatively approach against Gram-positive foodborne pathogens without altering the organoleptic properties of food products. However, in most of the cases, the activity and stability of naturally occurring enzymes is significantly lower than the biotechnological industry needs. Besides, there is a lack of research advances in lytic activity improvements of endolysins in food storage conditions. The experimental work developed in the scope of this thesis aimed at directing endolysin activity towards refrigeration temperatures against L. monocytogenes through the use of directed evolution strategies – error-prone PCR and cryodrilling. Different attempts were done for the isolation of listerial phages from livestock industries effluents and consequently identification and improvement of lytic activity of its derived endolysins. An in silico analysis of two different lysins – Ply500 and Ply511 – were performed to provide contextualization about their structure and domains. Although both proteins possess modular structure, Ply511 has a central catalytic domain and a not well characterized binding domain which contrasts to Ply500 domain organization. Protein expression in large and micro-scales of wild-type proteins was successfully done and confirmed by performing antibacterial tests against L. monocytogenes 5725. To enhance the activity of endolysins against L. monocytogenes cells, modified endolysins were constructed by amplifying their sequences using error-prone PCR technique and cloning into pQE-30 vector. The cloned vectors were transformed in E. coli JM109 competent cells, however no colonies were obtained. At the same time, using PlyP100 endolysin, a second approach based on the biotic interaction between phage-host at successively temperature was done to promote phage adaptation and consequently enzymatic evolution.

Listeria monocytogenes é um agente patogénico oportunista Gram-positivo, responsável por provocar listeriose, doença potencialmente mortal associada ao consumo de alimentos contaminados. A preocupação inerente à sua capacidade de sobreviver numa grande variedade de condições, o crescente número de surtos da doença e o aumento da resistência a antibióticos obrigam a que novas estratégias de conservação e preservação dos alimentos sejam desenvolvidas. Endolisinas derivadas de fagos são enzimas responsáveis pela lise das células do hospedeiro. Uma vez que não alteram as propriedades organoléticas dos alimentos, o uso destas enzimas representa uma boa alternativa na eliminação de agentes patogénicos Gram-positivos. Contudo, a baixa atividade e estabilidade das enzimas no seu estado natural torna-se incompatível com as necessidades industriais. Este trabalho experimental visou o melhoramento das propriedades líticas das endolisinas a temperaturas de refrigeração recorrendo a técnicas de evolução direta – error-prone PCR e cryodrilling. Numa primeira abordagem foram efectuadas tentativas para o isolamento de fagos de Listeria a partir de efluentes de indústria pecuária com posterior identificação e melhoramento das propriedades líticas das respetivas endolisinas. No entanto, as tentativas não foram bem-sucedidas. Foi efetuada a análise bioinformática das duas diferentes endolisinas – Ply500 and Ply511 – para se obter informações precisas sobre a sua estrutura. Apesar das duas proteínas possuírem uma estrutura modular, Ply511 apresenta um domínio catalítico central com função desconhecida e por conseguinte, pouco caracterizado, relativamente à organização modular de Ply500. A expressão das respetivas endolisinas wild-type em larga e micro escalas foi efetuada com sucesso e confirmada através de testes antibacterianos contra L. monocytogenes 5725. Para melhorar a atividade lítica das respetivas endolisinas, as sequências foram amplificadas por error-prone PCR, clonadas no vetor pQE-30 e transformados em células competentes E. coli JM109. No entanto, não foram obtidas quaisquer colónias. Ao mesmo tempo, usando a endolisina PlyP100, uma nova abordagem baseada no princípio de interação biótica entre fago-hospedeiro, foi efetuada a temperaturas sucessivamente mais baixas de forma a promover a evolução/adaptação do fago e consequentemente da endolisina.