Engineering of specific bacteriophages for early diagnosis of Alzheimer's disease

Abstract

Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder and the most common form of dementia. It affects mostly people over 65 years and the main symptoms are loss of memory and cognitive functions. Biologically, it is thought that this disease is characterized by the accumulation of a small peptide called amyloid beta (Aβ). This peptide aggregates into oligomers, the presumed real reason of synaptic disruption and memory loss. Recently, two sequences were described to recognize Aβ oligomers. So far no accurate diagnosis exists increasing the need to develop tools for early diagnosis. Nevertheless, it is difficult to access the brain due to the presence of the blood brain barrier (BBB). Based on the ability of the bacteriophage M13 to cross the BBB and the existence of sequences that recognize the Aβ, the main goal of this work was to develop an early diagnosis tool for AD diagnosis through the engineering of the bacteriophage M13 in order to express the Aβ sequences on its capsid. Different approaches were used to genetically manipulate the M13 genome in order to clone the peptide sequences, and it was possible to insert only the last four amino acids of one sequence. With this modified phage particle, immunohistochemistry assays were performed using AD model tissue from the hippocampus of a double transgenic mice APPswe/PS1dE9. The results of these assays proved promising, with a significant affinity of the modified phage towards the AD model tissue, and possibly to the Aβ oligomers. In short, the overall objectives of this work were accomplished, leaving the opportunity for further work to improve and validate this phage particle as an AD diagnosis tool.

A Doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa e a forma mais comum de demência. Esta doença afeta maioritariamente pessoas com mais de 65 anos e os seus sintomas são a perda gradual de memória e de funções cognitivas. Biologicamente, pensa-se que a principal causa desta doença é a acumulação de um pequeno péptido chamado amiloide beta (Aβ) na sua forma oligomérica. Recentemente foram descritas duas sequências que mostraram uma elevada afinidade aos oligómeros de Aβ. Até ao momento não foi descoberto nenhuma ferramenta de diagnóstico para DA. Um dos motivos principais para a falta de diagnóstico é a existência da barreira hematoencefálica. Esta barreira impede o acesso de moléculas, vírus entre outros ao sistema nervoso central. Tendo em conta os estudos que demonstram a capacidade do bacteriófago M13 para ultrapassar a barreira hematoencefálica e também a existência de sequências capazes de reconhecer Aβ na sua forma oligomérica, o objetivo principal deste trabalho foi a criação de uma plataforma de diagnóstico precoce para DA através da modificação genética do fago M13 de modo a este expressar à sua superfície as sequências Aβ. Durante a elaboração deste trabalho diferentes metodologias foram realizadas na tentativa de modificar geneticamente o fago M13. Através destas abordagens foi possível a obtenção de uma partícula fágica modificada possuindo na sua superfície os últimos quatro aminoácidos de uma sequência. Ensaios de imunohistoquímica foram realizados de modo a avaliar a afinidade do fago modificado para o tecido do hipocampo de ratos modelo da DA. Os resultados obtidos nestes ensaios mostraram-se promissores, sugerindo que o novo fago possui elevada afinidade para os oligómeros Aβ. Resumidamente, pode dizer-se que os objetivos gerais deste trabalho foram alcançados, deixando oportunidade de trabalhos futuros para o desenvolvimento de um modelo de diagnóstico para a DA, utilizando a partícula fágica obtida.