Impact of differential TLR recognition of Mycobacterium tuberculosis strains for the production of nitric oxide by macrophages

Abstract

Tuberculosis (TB) remains one of the major worldwide threats, with approximately one third of the world population infected with the causative agent of this disease, Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Recently developed genetic tools have showed the presence of a variety of Mtb lineages associated to the geographic distribution of the population. In our laboratory, we have been interested in the study of the immune response to Mtb strains from the Beijing family, associated to the East-Asian lineage, considered one of the most virulent Mtb lineages. The recognition of the mycobacteria soon after infection is important to promote efficient immune responses. Macrophages are one of the first innate immune cells to recognize Mtb. The capacity to eliminate the pathogen depends on the macrophage ability to recognize and develop the correct immune signaling through, for instance, the production of cytokines and of bactericidal compounds such as nitric oxide (NO). We previously found that particular Beijing Mtb strains were preferentially recognized through toll-like receptor 4 (TLR4) in addition to TLR2, and that this differential recognition had an impact in the pro- and anti-inflammatory responses of infected macrophages. In this work, we observed that a TLR4-activating Mtb strain 02-171, induced high expression of nitric oxide synthase 2 gene ( Nos2) and subsequent production of NO by infected macrophages comparatively to various TLR2-actvating Mtb strains. Our results demonstrated that this differential induction of Nos2 in Mtb strain 02-171-infected macrophages depended on the production of type I interferon (IFN) by these cells. Results from in vivo experiments showed that Mtb strain 02-171 also induced earlier and higher Nos2 expression in the lung of infected animals, as compared to TLR2-activating Mtb strains. Furthermore, our findings suggest a protective function for the early expression of Nos2 possibly to control the bacterial burden in mice infected with the TLR4-activating Mtb strain. As observed in macrophages, the regulation of Nos2 in infected mice was also dependent on type I IFN. Therefore, our results point to a protective function of early Nos2 expression and type I IFN production during infection with TLR4- activating Mtb strain and to the existence of an IFN-γ-independent regulation pathway of Nos2 expression in the context of infection by certain Mtb strains. Finally, we performed initial tests to determine the TLR4 ligand present in Mtb strain 02-171. We demonstrated that this ligand is most likely structurally different from lipopolysaccharide (LPS), thermosensitive and possibly dependent of live bacteria. This initial characterization of TLR4 ligand present in Mtb strain 02-171 will contribute to establish the experimental conditions required for an effective isolation of this molecule.

A tuberculose (TB) continua a ser uma das principais ameaças globais, com aproximadamente um terço da população mundial infectada com o agente provocador da doença, o Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Ferramentas genéticas recentemente desenvolvidas mostraram a presença de uma variabilidade de linhagens de Mtb associadas à distribuição geográfica da população. No nosso laboratório estudamos resposta imunológica a estirpes de Mtb da família Beijing, sendo estas associadas à linhagem Leste-Asiático e consideradas entre as mais virulentas linhagens de Mtb. O reconhecimento da micobactéria logo após a infecção é importante para promover uma resposta imunitária eficaz. Os macrófagos são células do sistema imune inato capazes de reconhecer o Mtb. A eliminação do agente patogénico depende da capacidade dos macrófagos em reconhecer o patogénio e desenvolver a correcta resposta imunológica através, por exemplo, da produção de citoquinas e compostos com propriedades bactericidas como o óxido nítrico (NO). Em estudo prévios verificamos que, para além do receptor de tipo toll 2 (TLR2), determinadas estirpes de Mtb Beijing (como a estirpe 02-171) eram preferencialmente reconhecidas através do TLR4. Este diferente reconhecimento tem um impacto na resposta pro e anti-inflamatória dos macrófagos infectados. Noe trabalho apresentado nesta tese, observamos que a estirpe de Mtb 02-171, em relação às estirpes de Mtb que activam o TLR2, induzia uma forte expressão do óxido nítrico sintase 2 ( Nos2) e consequentemente produção de NO em macrófagos infectados. Os nossos resultados demonstraram que a diferente indução de Nos2 em macrófagos infectados com a estirpe de Mtb 02-171 dependia da produção do interferão (IFN) tipo I. Os resultados das experiencias in vivo mostraram que, comparativamente às estirpes de Mtb que activam TLR2, a estirpe de Mtb 02-171 induzia num estado inicial alta expressão do Nos2 nos pulmões dos animais infectados. Além disso, os nossos resultados sugerem uma possível função protectora para a expressão de Nos2 no estado inicial da infecção, permitindo assim o controlo da carga bacteriana nos ratinhos infectado com a estirpe de Mtb que activa TLR4. Como verificado em macrófagos, a regulação de Nos2 nos ratinhos infectados também estava dependente do IFN tipo I. Assim, os nossos resultados apontam como uma função protectora a expressão do Nos2, no estado inicial da infecção, e a produção do IFN tipo I durante infecção com uma estirpe de Mtb que activam TLR4. A existência da uma regulação do Nos2 independente da via de regulação do IFN-γ, no contexto de uma infecção com certas estirpes de Mtb, é também evidenciada. Finalmente realizaram-se testes iniciais para determinar qual o ligando do TLR4 presente na estirpe de Mtb 02-171. Demonstramos que este ligando era estruturalmente diferente do lipopolissacarídeo (LPS), termo sensível e provavelmente dependente da bactéria viva. Esta caracterização inicial do ligando do TLR4 presente na estirpe de Mtb 02-171 irá contribuir para o estabelecimento das condições experimentais necessárias para o isolamento eficaz desta molécula.