Studying the role of lipocalin-2 in the pathophysiology of multiple sclerosis: looking beyond the brain

Abstract

Multiple sclerosis (MS) is an immune-mediated demyelinating disease of the central nervous system (CNS), characterized by the presence of demyelination plaques, inflammation and gliosis that consequently lead to axonal damage. The sequence of events that leads to demyelination remains unclear and the pathophysiological mechanisms are diverse. Also, although this is a disease of the CNS, there is no doubt that, in terms of peripheral organs, the thymus, as the organ of T cell differentiation and maturation, plays an important role in the pathophysiology of the disease. Recently, the levels of lipocalin 2 (LCN2), an acute phase protein that is part of the defense system against bacteria, by binding to iron-loaded siderophores, were found to be increased in cerebrospinal fluid (CSF) and serum of MS patients, when compared to control subjects. Similarly, using the MS animal model of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), LCN2 was detected in brain parenchyma astrocytes, in regions typically affected in MS patients. This expression by astrocytes, together with an increased LCN2 level in the CSF, occurs during the active phases of the disease, which could point towards a role for LCN2 secreted by astrocytes in the mediation of inflammatory responses in the EAE model. Altogether, these findings support LCN2 as a valuable molecule for the diagnostic/monitoring of MS and suggest its potential involvement as a disease modulator. Of relevance, the exact role of LCN2 in the pathophysiology of the disease remains largely unknown and contradictory data exists on its potential protective or deleterious effect. Therefore, we sought to investigate the role of LCN2 in the onset and progression of the disease. Herein, we tackled the disease, by evaluating the role of LCN2, not only in the perspective of the CNS, but also on the perspective of peripheral organs such as the thymus. First we intended to perform a characterization of the thymus regarding thymocyte populations and histological morphology, in wild-type (WT) animals induced with EAE, in the onset and chronic phases of disease. Next, to further understand the role of LCN2 in MS pathology, we induced EAE both in LCN2- null mice and in WT littermates. Non-induced EAE animals were used as controls. The thymus of EAE animals was atrophied, as assessed by its weight, normalized for total body weight, and by the number of total cells. Also, we found a decrease in total cell number of all thymocyte populations, during the onset and chronic phases of EAE. In relative terms, the percentage of double positive cells was decreased, and the percentages of the cluster of differentiation (CD)4 and CD8 single positive cells were increased, during the onset phase. At the chronic phase, the proportions between the different populations were restored. LCN2-null mice induced with EAE did not present major alterations in terms of the clinical score, when compared with WT littermates also induced with EAE. Likewise, their thymic alterations were similar to the ones observed in WT EAE animals. Of relevance, as for the inflammatory profile in the cerebellum, LCN2-null mice presented less inflammation, as assessed by decreased expression levels of proinflammatory cytokines interferon (Ifn)-gamma, interleukin (Il)12a and Il17a. Also of interest, the cerebellum of LCN2-null mice presented a decrease in the percentage of lesioned areas. Finally, EAE animals, from both genotypes, presented an increase in the area positive for glial fibrillary acidic protein (GFAP), in the white matter of the cerebellum, in both the onset and chronic phases of disease. On the contrary, the expression levels of Gfap in the cerebellum were only increased at the onset phase of disease.

A Esclerose Múltipla (EM) é uma doença autoimune desmielinizante do sistema nervosa central (SNC), caracterizada pela presença de placas de desmielinização, inflamação e gliose, que tem como consequência dano axonal. A sequência de eventos que induzem desmielinização permanecem desconhecidos, e os mecanismos patofisiológicos são diversos. Embora esta seja uma doença do SNC, não há dúvidas que, em termos de órgãos periféricos, o timo, sendo o órgão de maturação e diferenciação das células T, desempenha um papel importante na patofisiologia da doença. Recentemente, os níveis de lipocalin-2 (LCN2), uma proteína de fase aguda que participa no sistema de defesa contra infeções bacterianas, através da ligação a sideróforos, foram encontrados como estando elevados no líquido cefalorraquidiano (LCR) e no soro de doentes com EM, comparativamente aos controlos. Da mesma maneira, usando o modelo animal de EM de encefalomielite autoimune experimental (EAE), a LCN2 foi detetada em astrócitos do parênquima, em regiões tipicamente afetadas em doentes com EM. Esta expressão pelos astrócitos, associada a um aumento de LCN2 no LCR, ocorreu durante as fases ativas da doença, o que aponta para um papel da LCN2 secretada pelos astrócitos na mediação da response inflamatória no modelo de EAE. No seu conjunto, estas evidências suportam o papel da LCN2 como uma molécula importante no diagnóstico e/ou monitorização da EM, e sugere o seu possível envolvimento como moduladora da doença. É relevante dizer que o papel exato da LCN2 na patofisiologia da doença permanece desconhecido, e existem dados contraditórios no que diz respeito ao seu potencial efeito protetor ou deletério. Por isso, nós procurámos perceber o papel da LCN2 no onset e na progressão da doença. Assim, nós investigámos o papel da LCN2 na doença, não só na perspetiva do SNC, mas também dos órgãos periféricos, nomeadamente do timo. Primeiro pretendemos caracterizar o timo em relação às populações de timócitos e morfologia histológica, em animais wild-type (WT) induzidos com EAE, no onset e na fase crónica da doença. De seguida, para melhor entender o papel da LCN2 na patologia da EM, induzimos EAE em animais LCN2- null e em WT da mesma ninhada. Para além disso, usámos animais não induzidos como controlos. Nós observámos que o timo dos animais induzidos com EAE estava atrofiado, com base no seu peso, após normalização para o peso total do animal, e no número total de células. Para além disso, encontrámos uma diminuição no número total de células de todas as principais populações de timócitos, durante o onset e fase crónica da doença. No que diz respeito à percentagem de cada uma das populações de timócitos, durante o onset da doença, a percentagem de células duplas positivas encontrava-se diminuída, enquanto as percentagens das populações CD4+CD8- e CD4-CD8+ se encontrava aumentada. Na fase crónica da doença, as proporções entre as diferentes populações foram reestabelecidas. Os animais LCN2-null induzidos com EAE não apresentaram grandes alterações em termos de score clínico, quando comparados com os animais WT da mesma ninhada também induzidos com EAE. Para além disso, as alterações observadas no timo foram semelhantes às encontradas nos animais WT EAE. De relevância, no que diz respeito ao perfil inflamatório no cerebelo, os animais LCN2-null apresentaram menos inflamação, o que é suportado por níveis diminuídos dos níveis de expressão das citoquinas pró-inflamatórias interferão-gama, e interleucinas 12 e 17. É importante também referir que os cerebelos de animais LCN2-null apresentaram uma diminuição na percentagem de áreas com lesões. Os animais EAE, de ambos os genótipos, apresentaram um aumento na área positiva para GFAP, na substância branca do cerebelo, no onset e na fase crónica da doença. Pelo contrário, os níveis de expressão de Gfap no cerebelo só foram encontrados elevados no onset da doença.