Antisense therapy to control adhesion and filamentation of Candida albicans

Abstract

The incidence of fungal infections has increased significantly in the last years, contributing to the augment of morbidity and mortality in health care system. A raise in antimicrobial resistance, the number of immunosuppressive patients and the restricted number of antifungal drugs are the most common causes of these infections, where Candida species are the major responsible. The prevalence of these opportunistic infections, named candidiasis, has been attributed mostly to Candida albicans. Currently, conventional therapies, as antifungal drugs tend to be limitant in the control of these infections, and therefore antisense therapy (AST) arises as an alternative treatment. So, the main aim of this work was the development of a nano-drug, based in AST, for the control of virulence factors associated with Candida albicans infections. To accomplish the main goal, the C. albicans inter-strains variability concerning their ability to filament and adhere on abiotic surfaces, important virulence factors to be targeted by AST, was assessed. Then, an antisense oligonucleotide (ASO), capable of inhibiting the expression of HWP1 gene in C. albicans and reducing adhesion and filamentation was designed and optimized. The specificity and sensitivity of the probe was evaluated using C. albicans and other species by FISH assays. The ASO effects in the filamentation and adhesion was evaluated by microbiologic assays and the HWP1 expression levels determined by qRT-PCR. The results for inter-strains variability showed that strains SC5314 and 569322 had the highest capacity to adhere and filament and that 324LA/94 and 568426 were the strains with the lower capacity of filamentation. After the design of ASO and optimization of FISH conditions (37ºC as hybridization temperature, 4M of urea and 400 nM of ASO concentration), it was verified that the ASO was able to block 60% and 80% of the gene expression using concentrations of 40 nM and 200 nM, respectively, at 4h. On the other hand, the phenotype results demonstrated that the percentage of filamentation was only reduced by 3% and 6% for the 40 and 200 nM of ASO, respectively. However, the inclusion of urea, increased to 6 to 10% the reduction on filamentation. It was also possible to verify that the presence of urea inhibits the expression of this gene. In conclusion, it was demonstrated the possibility these nano-drugs, based in AST, as a novel strategy to control in future C. albicans virulence factors.

A incidência de infeções fúngicas aumentou significativamente, contribuindo para uma maior morbidade e mortalidade nos cuidados de saúde. Um aumento na resistência antimicrobiana, o número de pacientes imunossupressores e o número restrito de drogas antifúngicas são as causas mais comuns dessas infeções, onde as espécies de Candidas são as principais responsáveis. A prevalência dessas infeções oportunistas, denominadas por Candidíases, têm sido atribuídas principalmente a Candida albicans. Atualmente, as terapias convencionais, como drogas antimicóticas, tendem a ser cada vez mais limitantes no controlo dessas infeções e, portanto a terapia antisense surge como um tratamento alternativo. Assim, o objetivo principal deste trabalho consistiu no desenvolvimento de uma nano-droga baseada na tecnologia antisense, para o controlo de fatores de virulência associados infeções por Candida albicans. Para atingir o objetivo principal, foi avaliada a variabilidade inter-estirpes de C. albicans quanto à sua capacidade de filamentar e aderir às superfícies abióticas, importantes fatores de virulência a serem alvo da tecnologia antisense. Em seguida foi definida e otimizada a respetiva sonda de oligonucleótidos capaz de inibir a expressão do gene HWP1 em C. albicans, reduzindo assim alguns dos fatores de virulência associados. A especificidade e sensibilidade da sonda foram avaliadas através de C. albicans e outras espécies respetivamente, por ensaios de FISH. Os efeitos da sonda foram avaliados por ensaios microbiológicos e os níveis de expressão do gene HWP1 determinados por qRT-PCR. Os resultados da variabilidade entre estirpes, demonstraram que as estirpes SC5314 e 569322 possuíam a maior capacidade de adesão e filamentação, e as estirpes 324LA/94 e 568426 a menor capacidade de filamentar. Em relação à sonda definida, e após a otimização dos parâmetros de FISH (37ºC para temperatura de hibridação, 4M de ureia e uma concentração de sonda de 400 nM), verificou-se a capacidade de bloquear a expressão do gene em aproximadamente 60% e 80% para concentrações de 40 nM e 200 nM, respetivamente, às 4h. Por outro lado, os resultados do fenótipo demonstraram que a percentagem de filamentação foi reduzida apenas na ordem 3% e 6% para os 40 e 200 nM de ASO, respetivamente. No entanto, a inclusão de ureia aumentou para aproximadamente 6 e 10% o efeito na redução da filamentação. Apesar disso, também foi possível verificar que a presença de ureia inibe a expressão do gene HWP1. Em conclusão, ficou assim demonstrada a possibilidade de aplicar estas nano-drogas, baseadas na tecnologia antisense, como uma estratégia promissora para o controlo de infeções por C. albicans.