Otimização da produção de bioplásticos por engenharia metabólica

Abstract

A biotecnologia industrial tem sido aplicada na produção de uma vasta gama de compostos, incluindo químicos e polímeros de valor acrescentado, explorando o potencial de diversos microrganismos para obtenção destes produtos a partir de fontes renováveis. O aumento da necessidade de estabelecer processos biotecnológicos surgiu devido às preocupações ambientais e geo-políticas. Uma das soluções para reduzir os impactos ambientais, passa por desenvolver produtos ecológicos, nomeadamente os bioplásticos. Os PHBs (Poli-(R)-3-hidroxibutirato) são biopolímeros que têm um elevado interesse científico e industrial, visto que possuem características comercialmente atrativas, particularmente, propriedades biodegradáveis, biocompatíveis e termoplásticas. Por este motivo, revelam-se candidatos promissores para a produção em larga escala. A levedura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) é o microrganismo eucariota melhor caraterizado e mais utilizado em processos industriais. Possui um conjunto de características que o tornam um potencial candidato para aplicações de Engenharia Metabólica para servir como uma fábrica celular para a produção de compostos químicos em grande volume a partir de materiais lignocelulósicos (matéria renovável). Neste trabalho pretendeu-se desenvolver estirpes modificadas de S. cerevisiae através de estratégias in silico, capazes de produzir PHBs, a partir de materiais derivados da hidrólise de lignocelulose, particularmente xilose. Numa primeira fase foi feita a validação do modelo iMM904, em condições anaeróbias, com o intuito de verificar se o mesmo é capaz de reproduzir os resultados experimentais disponíveis na literatura. Inicialmente, a validação do modelo foi efetuada com glucose como fonte de carbono, devido à ausência de dados de fluxos experimentais na literatura sobre o crescimento de S. cerevisiae em xilose em condições anaeróbias. Posteriormente, procedeu-se à curação em xilose nas mesmas condições. Dado que existe pouca informação sobre fluxos em xilose, foi necessário efetuar um levantamento de dados experimentais disponíveis para o crescimento de S. cerevisiae com este açúcar. Porém, não foi possível chegar aos valores contidos na literatura e validar o modelo em xilose. A segunda fase, sendo o objetivo primordial deste estudo, consistiu na construção in silico de estirpes mutantes de S. cerevisiae para produção de PHBs em xilose. A otimização in silico, usando um modelo à escala genómica de S. cerevisiae (iMM904) foi realizado em OptFlux. Esta ferramenta computacional aplica Algoritmos Evolucionários e Simulated Anneling para encontrar conjuntos de inativações de reações que maximizem a produção de PHBs. Vários conjuntos de inativações foram obtidos pelos resultados de otimização. Foram escolhidas duas soluções: a primeira continha três reações inativadas e a segunda quatro. Analisando os resultados da simulação dos fenótipos, obtidos pelo método pFBA em condições anaeróbias nas duas soluções, verificou-se um rendimento de produção robusta para ambas as soluções: 0,11 mmol PHB/mmol xilose e 0,13 mmol PHB/mmol xilose. Neste trabalho, foram avaliadas duas estratégias in silico para a obtenção de estirpes modificadas em S. cerevisiae a partir de xilose que, no futuro, poderão ser implementadas para o desenvolvimento de um processo de fermentação de PHBs economicamente viável.

Industrial biotechnology has been applied in the production of a wide range of compounds, including chemicals and added-value polymers, exploiting the potential of various microorganisms in order to obtain these products from renewable sources. The increased need to establish biotechnological processes has arisen due to environmental and geo-political concerns. To be able to reduce the environmental impact, one of the solutions is to develop environmentally friendly products, namely bioplastics. PHBs (Poly-(R)-3-hydroxybutyrates) are biopolymers which have a high scientific and industrial interest, since they have commercially attractive characteristics, particularly, biodegradable, biocompatible and thermoplastic properties. For these reasons, they reveal themselves as promising candidates for large-scale production. The yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is the best characterized and most used eukaryotic microorganism in industrial processes. It has a set of characteristics that make it a potential candidate for Metabolic Engineering applications to serve as a cellular factory for the production of large volume chemical compounds, from lignocellulosic materials (renewable feedstock). In this work we intended to develop modified strains of S. cerevisiae through in silico strategies, capable of producing PHBs, from hydrolysis derived materials of lignocellulose, particularly xylose. In a first phase, the iMM904 model was validated under anaerobic conditions, in order to verify if it was able to reproduce the experimental results available in literature. Initially, model validation was performed with glucose as a carbon source, due to the absence of data regarding experimental fluxes in the literature on the growth of S. cerevisiae in xylose under anaerobic conditions. Subsequently, we proceeded to curate the model in xylose under the same conditions. Since there is little information on xylose fluxes, it was necessary to carry out a survey of available experimental data for the growth of S. cerevisiae with this sugar. However, it was not possible to reach the values contained in literature in order to validate the model in xylose. The second phase, the main objective of this study, consisted in the in silico construction of mutant strains of S. cerevisiae to produce PHBs from xylose. In silico optimization using a genome scale model of S. cerevisiae (iMM904) was performed on OptFlux. This computational tool applies Evolutionary Algorithms and Simulated Anneling to find sets of inactived of reactions that maximize PHB production. Several sets of inativations were obtained by the optimization results. Two solutions were chosen: the first contained three inactivated reactions and the second four. Analyzing the phenotype simulation results obtained by the pFBA method under anaerobic conditions for the two solutions, we found robust production yields for both solutions: 0.11 mmol PHB/mmol xylose and 0.13 mmol PHB/mmol xylose. In this work, two in silico strategies was evaluated for obtaining an engineered strains of S. cerevisiae from xylose, that can be further implemented for development a cost-effective PHBs fermentation process.