The influence of cancer cell metabolism and microenvironment on tumour progression and drug resistance

Abstract

In the last years a new revival interest has been demonstrated in the reprogrammed metabolism of cancer cells. Described by Otto Warburg, the altered metabolism characterized mainly by a high dependence on lactic acid fermentation, even in the presence of oxygen, is an emergent hallmark of cancer cells. The increase of the glycolytic flux induces a high acidity of the extracellular space, maintained by overexpression of different pH regulators at the plasma membrane, and enhances the more aggressive characteristics of tumour cells, such as increased migration and invasion abilities and resistance to therapy. Therefore, the altered metabolism can be an excellent target for the development of new therapies in cancer field. The reverse pH gradient establish an interplay between cancer metabolism and the surrounding environment. Furthermore, the ablation of pH regulation on cancer cells can be a second way to overcome the major obstacle in antitumour therapy, the multidrug resistance. This phenotype is identified in other cell population that reside inside a tumour mass, beside the tumour parenchymal cells, the cancer stem cells (CSCs), the main responsible for tumour relapse. Recently, it has been described that the reprogrammed metabolism is an emergent target to eliminate this tumour population and to increase the survival rates in many different types of cancer. However, new efforts are needed to improve the knowledge obtained until now on this cancer hallmark. For that reason, this work aims to study and characterize the role of reprogrammed metabolism in different types of cancer, gliomas and pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) cells and the derived CSCs. Additionally, we aimed to study how this altered phenotype can be modulated, using bioenergetic modulators (BMs), combined or not with conventional drugs. The metabolic profile of the different cell lines was analysed through quantification of lactate production, glucose consumption and intracellular ATP. Concerning the inhibition of the main energetic pathways, it was performed using the glycolytic inhibitors dichloroacetate (DCA), 2-deoxy-D-glucose (2-DG) and the OXPHOS inhibitor and antidiabetic drug, phenformin. All BMs induced a decrease in tumour cell proliferation, and when combined with the conventional antitumour drugs, temozolomide (TMZ) in case of glioma cells, and paclitaxel albumin nanoparticles (NAB-PTX) for pancreatic cancer cells, an increase of drug cytotoxicity was found. Furthermore, when using an in vivo glioma model, the chicken chorioallantoic membrane, all BMs showed an elevated specificity targeting only tumour cells. Additionally, all BMs, namely the glycolytic inhibitors, induced an altered metabolic profile and decrease in migration and invasion abilities in glioma cells. Regarding pancreatic cancer cells, we observed a higher dependence on glycolysis for both cell lines in 2D cell culture. In CSCs, this metabolic profile was more evident in 3D conditions, when an extracellular matrix with higher percentage of collagen was used. Additionally, we verified that the BMs affected the metabolic behaviour of both cell lines. For the parenchymal cells, glycolysis and OXPHOS were important in PANC-1 cell proliferation, but the effect was dependent of the growth substrate. CSCs presented a very complex pattern, showing metabolic plasticity, where inhibition of one pathway can be compensated by others. For instance, it was verified that the CSCs redirected their metabolism to glycolysis as the main energy source, when OXPHOS was inhibited by phenformin. The combination of NAB-PTX with BMs decreased cell proliferation and increased cell death, namely for phenformin in CSCs. The second objective was to unravel the role of the pH regulators, in cancer characteristics. The hyper-glycolytic acid-resistant phenotype has been described in many type of cancers, namely in breast cancer, the other model used in this work. For that, the expression of pH regulators was evaluated both in breast cancer clinical samples and breast cancer cell lines. We observed an overexpression of these proteins, indicating that they can be used as predictive biomarkers in breast cancer diagnosis. Specific inhibitors for these proteins were used and the main characteristics of tumour cells were evaluated. All the compounds decreased cell viability as well as, the migration and invasion abilities of cancer cells. Furthermore, when combined with the conventional drug, doxorubicin, one of the first line drugs used in breast cancer chemotherapeutic regimens, a synergistic effect we observed. To conclude, this study suggests that tumour metabolism behaves as a mediator between tumour cells and the tumour microenvironment, being an important player in tumourigenesis and in the aggressive phenotype of cancer cells. Thus, blockage of the main players involved in this relationship, can disrupt the mechanism responsible for treatment failure in these three types of cancers and improve the existent therapeutic options used in clinical practice.

Nos últimos anos tem sido registado um aumento do interesse na reprogramação metabólica das células tumorais. Descrito pelo cientista Otto Warburg, a reprogramação metabólica caracterizada nomeadamente pela elevada dependência da fermentação láctica, mesmo na presença de oxigénio, é uma característica emergente das células tumorais. O aumento do fluxo glicolítico leva a uma maior acidez do espaço extracelular, mantida pela sobreexpressão de reguladores de pH na membrana plasmática celular, o que induz caraterísticas mais agressivas por parte das células tumorais, como a capacidade de migração e invasão e resistência à terapia. Portanto, o metabolismo alterado pode ser um excelente alvo no desenvolvimento de novas terapias no ramo da oncobiologia. O gradiente de pH reverso, mantido pela sobre-regulação de reguladores de pH nas células tumorais, estabelece uma relação entre o metabolismo das células tumorais e o microambiente circundante. Para além disso, o bloqueio da regulação de pH nas células tumorais pode ser uma segunda alternativa para ultrapassar o maior problema na terapia anti-tumoral, a resistência a múltiplos fármacos. Este fenótipo foi igualmente identificado numa outra população de células que reside dentro da massa tumoral, para além das células tumorais parenquimatosas, as células estaminais tumorais, principais responsáveis pela recorrência do tumor. Recentemente, tem sido descrito que o metabolismo reprogramado é um alvo terapêutico emergente para eliminar a população tumoral e aumentar as taxas de sobrevivência em diferentes tipos de cancro. No entanto, são necessários mais estudos para aumentar o conhecimento obtido até então acerca desta característica tumoral. Por esta razão, este trabalho tem como objetivo estudar e caracterizar o papel do metabolismo alterado em diferentes tipos de cancro, gliomas e adenocarcinoma ductal do pâncreas (ACDP) e as células estaminais tumorais derivadas. Adicionalmente, pretendeu-se estudar como se poderia modificar este fenótipo, usando moduladores bioenergéticos (MB), combinados ou não com fármacos convencionais. O perfil metabólico das diferentes linhas celulares foi analisado através da quantificação da produção de lactato, consumo de glucose e ATP intracelular. Relativamente à inibição das principais vias metabólicas, esta foi realizada usando os inibidores glicolíticos dicloroacetato e 2-desoxiglucose e o inibidor da fosforilação oxidativa e fármaco antidiabético, a fenformina. Todos os MBs induziram uma diminuição da proliferação das células tumorais, e quando combinados com fármacos antitumorais convencionais, a temozolamida no caso das células de glioma, e paclitaxel associado à albumina no caso das células tumorais pancreáticas, foi observado um aumento da citotoxicidade do fármaco. Para além disso, quando utilizado um modelo in vivo de glioma, a membrana corioalantóide de galinha, todos os MBs mostraram uma elevada especificidade, atuando apenas nas células tumorais. Relativamente ao ACDP, observamos uma elevada dependência pela glicólise nas duas linhas celulares em culturas em 2D. Nas células estaminais tumorais, este perfil metabólico foi mais evidente em condições de crescimento 3D, quando se utilizou uma matriz extracelular com elevada percentagem de colagénio. Adicionalmente, verificou-se que os MBs afetaram o comportamento metabólico de ambas as linhas celulares. Nas células parenquimatosas a glicólise e a fosforilação oxidativa foram importantes na proliferação das células PANC-1, mas este efeito foi dependente do substrato de crescimento. As células estaminais tumorais apresentaram um padrão muito complexo, mostrando uma plasticidade metabólica, onde a inibição de uma via metabólica pode ser compensada por outras. Por exemplo, foi verificado que as células estaminais tumorais redirecionaram o seu metabolismo para a glicólise como principal fonte de energia, quando a fosforilação oxidativa foi inibida pela fenformina. A combinação do paclitaxel associado à albumina com os MBs diminuiu a proliferação celular e aumentou a morte celular, nomeadamente para a fenformina nas células estaminais tumorais. O segundo objetivo deste trabalho foi o estudo do papel dos reguladores de pH nas características tumorais. O fenótipo hiper-glicolítico ácido-resistente tem sido descrito em vários tipos de cancro, nomeadamente no cancro de mama, outro dos modelos utilizados neste trabalho. Assim, a expressão dos reguladores de pH foi avaliada em amostras humanas de tecidos e linhas celulares de cancro de mama. Observamos uma sobre-expressão dessas proteínas, indicando que podem ser usadas como biomarcadores preditivos no diagnóstico deste tipo de cancro. Foram utilizados inibidores específicos destes reguladores foram utilizados e as principais características tumorais foram avaliadas nestas condições. Todos os inibidores diminuíram a viabilidade celular, assim como, a capacidade de migração e invasão por parte das células tumorais. Adicionalmente, quando utilizados simultaneamente com o fármaco convencional doxorrubicina, um dos fármacos de primeira linha utilizada nos regimes de quimioterapia no cancro de mama, foi observado um efeito sinérgico. Em conclusão, este estudo sugere que o metabolismo das células tumorais funciona como mediador entre estas células e o microambiente tumoral, sendo um fator importante na carcinogénese e no fenótipo mais agressivo das células tumorais. Portanto, a inibição dos principais intervenientes nesta correlação pode bloquear o mecanismo responsável pela falta de eficácia do tratamento nestes três tipos de cancro e potenciar as opções terapêuticas utilizadas na prática clinica.