Development of a bioprocess for the production of xylooligosaccharides

Abstract

The demand of prebiotic ingredients, such as xylooligosaccharides (XOS), has been growing over the years as consumers pay more attention to their health and well-being. XOS are considered emergent and competitively priced prebiotics, presenting high potential as food ingredients. As a result, the industry is focused on developing new approaches to improve production efficiency that can meet the increasing demand while reducing costs. Motivated by the industry needs, the main purpose of this thesis was to develop an integrated bioprocess, based on one-step fermentation, for the production of prebiotic XOS, towards the simplification and cost reduction of the process. The one-step fermentation of 13 agro-residues was performed using two Trichoderma species. The most promising results were found for T. reesei using brewers’ spent grain (BSG) as substrate. BSG is an inexpensive and abundant brewery agro-industrial residue that was herein proven interesting for the production of prebiotic arabino-xylooligosaccharides (AXOS). Under optimal conditions (3 days, pH 7.0, 30°C and 20 g/L of BSG), a production yield of 38.3 ± 1.8 mg/g (xylose equivalents/g of BSG) was achieved. AXOS with degree of polymerization (DP) from 2 to 5 were obtained. The onestep fermentation using T. reesei was compared with the application of a commercial xylanase from T. longibrachiatum. The first revealed to be a more attractive and low-cost strategy to hydrolyze sterilized raw BSG (without conventional pretreatment) and produce AXOS. In order to reduce the production time obtained with T. reesei (3 days), the Bacillus subtilis 3610 wild type (wt) was successfully used, for the first time, to produce AXOS through direct fermentation of BSG, reducing the production time to 12 h. Genetic engineering was used to further optimize the microorganism performance, by cloning the T. reesei xylanase gene coupled with a secretion tag into the B. subtilis chromosome (B. subtilis 3610 clone 2). After optimization by Box-Behnken experimental design, AXOS with a DP ranging from 2 to 6 were obtained at 12 h of fermentation with B. subtilis 3610 clone 2, using 20 g/L of BSG, at pH 7.0 and 45°C. The maximum production yield was 54.2 ± 1.1 mg/g (xylose equivalents/g of BSG), representing an increase of 33% comparing to the wt, and 29% comparing to the T. reesei. B. subtilis 3610 clone 2 was also selected for downscale production of XOS by direct fermentation of commercial beechwood xylan. The use of a commercial substrate allowed to better evaluate strategies to overcome common process limitations associated to the use of agro-residues as substrates, namely biomass measurement, mass transfer issues and substrate inhibition. The maximum production yield, 306 ± 4 mg/g (XOS/xylan), was achieved after 8 h of fermentation operating under one-time impulse fed-batch regimen. The optimal conditions found were pH 6.0 and 42.5°C, using 2.5 g/L of initial concentration of xylan increased up to 5.0 g/L at 3 h. A mixture of XOS with a DP ranging from 4 to 6 was obtained, presenting high stability after a static in vitro digestion (98.5 ± 0.2)%. Operating under fed-batch mode allowed to minimize the effect of substrate inhibition, which led to a great increase of the production yield. In vitro studies using human fecal inocula of two healthy donors were performed to evaluate and compare the potential prebiotic effect of commercial lactulose and the XOS herein produced through direct fermentation of beechwood xylan by B. subtilis clone 2. For both substrates, acetate was the main short-chain fatty acid (SCFA) produced during fermentation at 48 h. Lactulose led to the highest production of lactate, while XOS led to the maximum production of butyrate (9.0 ± 0.6 mM for donor 1 samples, and 10.5 ± 0.8 mM for donor 2 samples). The addition of XOS also resulted in the largest production of CO2. The significant increase in the production of SCFAs and CO2, added to the reduction of pH and ammonia concentration suggest that the XOS herein obtained hold potential functional properties for human health. The results gathered in this thesis are very promising, specially from the industrial perspective, providing important insights for the development of new integrated strategies for XOS production from agro-residues.

A procura de ingredientes prebióticos, como os xiloligossacarídeos (XOS), tem crescido ao longo dos anos, à medida que os consumidores prestam mais atenção à sua saúde e bem-estar. Os XOS são considerados prebióticos emergentes e com preços competitivos, apresentando alto potencial como ingredientes alimentares. Consequentemente, a indústria está focada no desenvolvimento de novas abordagens para melhorar a eficiência da produção, para reduzir custos e atender à crescente procura. Motivada pelas necessidades da indústria, o objetivo principal desta tese foi desenvolver um bioprocesso integrado, baseado numa única fermentação para a produção de XOS, visando a simplificação e redução de custos do processo. A fermentação direta de 13 agro-resíduos foi realizada utilizando duas espécies Trichoderma. Os resultados mais promissores foram observados para o T. reesei, usando dreche (BSG) como substrato. A dreche é um resíduo agro-industrial barato e abundante, proveniente da indústria cervejeira que provou ser interessante para a produção de arabino-xilooligossacarídeos (AXOS). Sob condições ótimas (3 dias, pH 7,0, 30°C e 20 g/L de BSG), obteve-se um rendimento de produção de 38,3 ± 1,8 mg/g (equivalentes de xilose/g de BSG). Os AXOS obtidos apresentaram um grau de polimerização (DP) entre 2 e 5. A produção de AXOS através de fermentação com T. reesei foi comparada com a aplicação de uma xilanase comercial de T. longibrachiatum. A fermentação revelou ser uma estratégia mais atrativa e de baixo custo para hidrolisar a dreche esterilizada por autoclave (sem pré-tratamento convencional) e para produzir AXOS. De modo a reduzir o tempo de produção obtido com o T. reesei (3 dias), estudou-se, pela primeira vez, a produção AXOS através de fermentação direta da dreche usando o Bacillus subtilis 3610 wild type (wt), o que levou à redução do tempo de produção para 12 h. Recorrendo a engenharia genética, o desempenho do microrganismo foi otimizado, através da integração no seu cromossoma do gene da xilanase do T. reesei acoplado a um tag de secreção (B. subtilis 3610 clone 2). Após otimização do processo com recurso a um desenho experimental de Box-Behnken, foram produzidos AXOS com DP de 2 a 6 após 12 h de fermentação com o B. subtilis 3610 clone 2, utilizando 20 g/L de BSG, pH 7,0 e 45°C. O rendimento máximo de produção foi de 54,2 ± 1,1 mg/g (equivalentes de xilose/g de BSG), representando um aumento de 33% em relação à wt e 29% em relação ao T. reesei. O B. subtilis 3610 clone 2 foi também selecionado para a produção em menor escala de XOS através da fermentação direta de xilano comercial obtido de madeira de faia. O uso de um substrato comercial permitiu uma melhor avaliação das estratégias necessárias para superar as limitações que são geralmente associadas ao uso de agro-resíduos, nomeadamente, a quantificação da biomassa, os problemas de transferência de massa e a inibição pelo substrato. O rendimento máximo de produção, 306 ± 4 mg/g (XOS/xilano), foi observado após 8 h de fermentação, operando sob regime de fed-batch com um impulso. As condições ótimas encontradas foram pH 6,0 e 42,5°C, utilizando 2,5 g/L de concentração inicial de xilano aumentada para 5,0 g/L às 3 h. Nestas condições obteve-se uma mistura de XOS com um DP entre 4 e 6, que apresentou elevada estabilidade (98,5 ± 0,2%) após ter sido sujeita a um processo de digestão estática in vitro. A produção em modo fed-batch permitiu ainda minimizar o efeito da inibição do substrato, o que levou a um aumento significativo do rendimento de produção. Foram realizados estudos in vitro com inóculos fecais humanos de dois dadores saudáveis para avaliar e comparar o potencial efeito prebiótico da lactulose comercial e da mistura de XOS produzida por fermentação direta de xilano de madeira de faia usando o B. subtilis clone 2. Para ambos os substratos, o acetato foi o principal ácido gordo de cadeia curta (AGCC) produzido após 48 h de fermentação. A lactulose apresentou a produção mais elevada de lactato, enquanto que os XOS apresentaram a produção mais elevada de butirato (9,0 ± 0,6 mM para o doador 1 e 10,5 ± 0,8 mM para o doador 2). A adição de XOS ao meio de cultura também resultou numa produção mais elevada de CO2. O aumento significativo na produção de AGCCs e CO2, bem como a redução do pH e da concentração de amónia, sugere que os XOS produzidos neste trabalho podem apresentar propriedades funcionais importantes para a saúde humana. Os resultados obtidos nesta tese são bastante promissores, especialmente do ponto de vista industrial, apresentando-se informação relevante para o desenvolvimento de novas estratégias integradas para a produção de XOS a partir de agro-resíduos.