Bacteriophages to control STEC contamination of food: a safety assessment

Abstract

Bacteriófagos (fagos) são uma potencial ferramenta no controlo de Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC), com vários estudos a demonstrar a sua eficácia. O uso generalizado de produtos à base de fagos na União Europeia tem sido adiado devido a preocupações com a sua segurança. Para o controlo de STEC, isto torna-se ainda mais relevante devido ao impacto que os agentes de desinfeção terão na expressão do gene de virulência mais relevante (toxina Shiga), ou na microbiota comensal do intestino humano. O principal objetivo deste trabalho é a definição de um conjunto de ensaios que permita avaliar a segurança do uso de fagos no controlo de STEC. Três importantes preocupações foram identificadas: (1) a patogenicidade e virulência de Mutantes Insensíveis aos Bacteriófagos (BIMs); (2) indução dos fagos que contem o gene da toxina Shiga (fagos Stx) e da expressão da toxina; (3) efeito dos fagos na microbiota de indivíduos saudáveis. Inicialmente, foi realizado uma análise ao genoma completo dos fagos Stx para caracterizar a prevalência dos genes da toxina Shiga nos isolados clínicos e alimentares. A análise revelou uma grande diversidade de fagos Stx, capazes de infetar um amplo conjunto de serotipos, potenciando assim a capacidade de converter diferentes estirpes de E. coli em STEC. Foi também demonstrado que os genes stx encontram-se perto da cassete lítica, indicando que a expressão da toxina está ligada à indução e libertação dos fagos Stx. Em seguida, para avaliar as questões de segurança mencionados anteriormente, o fago Ace, isolado e caracterizado neste estudo, foi usado como fago modelo para os ensaios de segurança. O contacto recorrente do fago Ace com uma estirpe STEC, resultou em BIMs com perfis de persistência similares à estirpe original. No entanto, estes BIMs demonstraram ser mais sensíveis à atividade do complemento do soro humano. A ausência do antigene O157 foi demonstrado para algumas colónias, o que pode justificar a maior sensibilidade à atividade antimicrobiana do soro. Por outro lado, a infeção de STEC com fago Ace não induziu a libertação de fagos Stx, nem a produção da toxina Shiga. Para determinar o efeito do fago Ace na microbiota do intestino, foi proposto um modelo de fermentação in vitro, usando como inóculo o conteúdo fecal de indivíduos saudáveis. A estabilidade da microbiota foi avaliada por monitorização dos metabolitos da fermentação e validada por análise metagenómica. Este estudo demonstrou que o fago Ace é seguro quando introduzido em diferentes microbiotas. Em suma, este trabalho focou-se nos aspetos mais relevantes relacionados com a segurança do uso de fagos no controlo de patógenos alimentares. O trabalho centrou-se na caracterização da segurança de um fago no controlo de STEC e permitiu concluir que este fago é seguro. Uma vez que esta conclusão não pode ser generalizada para outros fagos, este estudo é sobretudo relevante como um documento orientador para estudos de segurança de fagos usados no biocontrolo de STEC.

Bacteriophages (phages) are a promising tool for the biocontrol of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC), with several studies demonstrating their efficacy. Safety concerns still impair the generalized usage of phage-based products in food biocontrol inside the European Union. Safety aspects are particularly relevant in STEC since these biocontrol agents may have impact on the expression of the major virulence genes (Shiga toxins), or on the commensal microbiota of the human gut. In this work, it was aimed at establishing an analytic pipeline to evaluate the safety of using lytic phages in STEC biocontrol. Three important safety concerns were identified: (1) Bacteriophage Insensitive Mutants (BIMs) virulence and pathogenicity; (2) Shiga toxin-encoding phages (Stx phages) induction and Shiga toxin expression; (3) lytic phage outcome when introduced in a healthy human colon microbiota. To address the aim of this work, firstly, it was performed a whole-genome analysis of Stx phages to characterize the prevalence of Shiga toxin genes among food and clinical isolates. The analysis revealed a great diversity of Stx phages, able to infect a wide range of STEC serotypes. In fact, it was shown that similar Stx phages can infect different serotypes, rendering them the ability to convert different E. coli strains into STEC pathotype. Importantly, without exception, it was shown that stx genes are near the lytic cassette, which indicates that toxin expression is linked to prophages induction and release. Secondly, to assess the three important safety concerns mentioned above, a newly isolated and characterized phage, the lytic phage Ace, was used as a model phage in the subsequent safety assays. The recurrent contact of phage Ace and STEC strain resulted on the appearance of BIMs, which were shown to have similar persistence profiles as the wild type (WT) strain. Moreover, BIMs tend to be less resistant to the serum complement activity. In fact, some colonies were lacking the O157 antigen, which might render the colonies more susceptible to serum killing. Phage Ace did not induce Stx phage or Shiga toxin production upon STEC infection. By controlling the growth of STEC strain, less prophage was being induced, and, subsequently, less production of Shiga toxin was observed. To assess the impact of phage Ace in the colon microbiota, an in vitro fermentation model using faecal content of healthy subjects, was proposed. This model has proved phage Ace safe when introduced in different microbiotas. Microbiota stability was assessed by monitorization of fermentation metabolites and validated by metagenomics analysis. Overall, this work focussed on the most relevant aspects of phage safety that are still impairing their widespread application as biocontrol agents. Considering STEC control, this work shows that the use of phage Ace is safe; however, due to the diversity of phages that might be used in biocontrol, this safety outcome cannot be generalized to other phages. Nevertheless, this study might be useful as a guiding strategy for future safety assessments of phages used to control STEC in the food industry.