Laccase: a green catalyst for biosynthesis of poly-phenols

Abstract

Laccase is one of the multi-copper oxidases which can catalyze the oxidation of phenols, aromatic amines and other compounds using oxygen as the terminal electron acceptor. As an environment protecting biocatalyst, laccase shows great potential applications in various fields and industries, including textile industry, pulp and paper industry, environmental pollutant conversion and others In the field of synthesis, laccase catalyzed reactions have been widely investigated. However, the mechanism of laccase catalyzed aromatic compounds still needs to be further explored. The research and development of laccase on the polymer making study meet with requirement of the green chemistry, which will promote the application of the synthetic polymer materials. This PhD thesis intends to explore new strategies and mechanisms for the synthesis of aromatic polymers using different laccase forms and different reactors. Aromatic polymers were prepared using laccase from ascomycete Myceliophthora Thermophila. Different modifications of laccase were designed to improve its performance, including PEGylation and/or immobilization. Molecular modeling simulations were used to predict the geometry and structural changes of laccase. During the polymerization process, three reactors with different energy environment were applied, and the function of high-energy environment was investigated with the assistance of homology modelling and molecular simulation. The polymers obtained were characterized and applied onto different fabrics to achieve multi-functional fabrics. This study will provide fundamental knowledge for the polymer synthesis by laccase, and offer the theoretical and technical support for the establishment of high efficiency laccase-catalyzed synthesis system. Firstly, the polymerization of catechol was conducted using laccase as catalyst. Polyethylene glycol (PEG) was used in both non-covalent and covalent modification of laccase, then the performance of modified laccase was evaluated. The catalytic performance of different laccases was compared in both aqueous and gel phases. The results show that both non-covalent and covalent modification of laccase using PEG (PEGylated laccase) could promote the polymerization and improve the polymerization yield, as well as the degree of polymerization. However, these events were only detected in aqueous state. Molecular simulation shows that the presence of PEG slows down the inactivation of laccase. Later, the immobilization of laccase and PEGylated laccase was performed with epoxy resins as the carrier, using PEG also as linker compound to connect laccase and epoxy resin. The performance of immobilized laccase in aqueous solution for polymerization was explored and the structure of the polymer formed was proposed. After immobilization, the half-life time of laccase was improved, as well as the stability. The MALDI-TOF MS analysis showed that, when epoxy-native laccase, epoxy-PEGylated laccase and epoxy-PEG-laccase were used, the degree of polymerization was enhanced with the presence of immobilized laccase. Secondly, different reactors namely water bath, ultrasonic bath and high-pressure homogenizer were applied to perform the polymerization of catechol. The activity and stability of laccase in those reactors were discussed. The pathway and mechanism of laccase synthesis in high-energy environment were investigated. The polymers were characterized to speculate their structures. The results showed that high-energy environment promote the interaction between enzyme and substrate, incrementing the polymerization yield. The conversion yield when using the ultrasonic bath and high-pressure homogenizer was higher than when water bath was applied. Laccase under ultrasound and high-pressure homogenization showed less stability compared with under normal water bath, however, the polymerization proceeds earlier than this inactivation, thus no obvious negative effect on the synthesis was detected. The performance of native, PEGylated and Epoxy-PEGylated laccases was studied under the high-pressure homogenizer. Their activity and stability were compared and the corresponding polymers produced were evaluated. Both PEGylated laccase and Epoxy-PEGylated laccase showed the greatest catalytic properties and stability. Afterwards, catechol and p-phenylenediamine were polymerized using polyester (PET), cotton and wool as enzyme container in a high-pressure homogenizer using laccase as catalyst. The functionalization of fabrics was achieved via in-situ polymerization of aromatic substrate onto fabric containers. Both polymers, poly(catechol) and poly(p-phenylenediamine), present good thermal stability and resistance to thermal degradation, as well as free radical scavenging ability. Colored polymers were generated which conferred color to the fabrics. The scanning electron microscopy (SEM) observation shows uniform distribution of the polymer on the surface of cotton, wool and PET. All the fabrics reveal color fastness to washing, sunlight and rubbing. The conductivity of fabrics was determined after treatment with poly(p-phenylenediamine) and all the fabrics showed good conductivity. Both polymers are able to confer antimicrobial activity to all the coated fabrics against Gram positive (S. aureus) and Gram-negative (E.coli). The cytotoxicity tests performed on functionalized fabrics revealed that both polymer diffusion and porous fabric structure may affect cell viability, which could be avoided by the adjustment of the polymer concentration. This project aims to study the impact of the enzyme modification and processing conditions on the structure of the multi-functional reaction products, and aims to set up a high efficiency reaction system for laccasecatalyzed synthesis of a wide range of phenolic compounds. The oligomers/polymers obtained are supposed to show different functions to be applied on textile, medical and other areas.

A lacase é uma das oxidases multicobre que é capaz de oxidar compostos fenólicos, aminas aromáticas e outros compostos usando o oxigénio como aceitador de electrões. Sendo um biocatalisador ambientalmente aceite, a lacase mostra elevado potencial em diversas áreas de investigação assim como ao nível industrial, incluindo a Industria Têxtil, a Industria do papel, e na área de conversão de agentes poluentes, entre outros. No campo da síntese, as reações catalisadas pela lacase têm sido intensamente investigadas, no entanto o mecanismo de catálise de compostos aromáticos necessita de ser estudado em maior profundidade. A pesquisa e desenvolvimento da lacase na produção de polímeros atendem aos requisitos da química verde, o que promoverá uma vasta aplicação dos materiais poliméricos sintéticos. Esta tese de doutoramento pretende explorar novas estratégias e mecanismos para a síntese de polímeros usando lacase em diferentes formas e diferentes tipos de reatores. Os polímeros aromáticos foram produzidos usando a lacase do fungo ascomicete Myceliophthora Thermophila. Foram desenhadas diferentes modificações para a lacase de modo a incrementar a sua performance, que incluíram a PEGilação e/ou imobilização. Ao mesmo tempo foram realizadas simulações de modelação molecular de forma a prever a geometria e as modificações estruturais da enzima. Durante o processo de polimerização, foram estudados três tipos de reatores com distintos níveis de energia associados. Os polímeros obtidos foram caracterizados e aplicados em diferentes substratos de forma a obter tecidos multi-funcionais. Este estudo visa fornecer conhecimento fundamental sobre a síntese de polímeros pela lacase promovendo ao mesmo tempo suporte teórico e técnico para o estabelecimento de sistemas catalíticos eficientes. Primeiramente, a polimerização do catecol foi feita usando a lacase como catalisador. O polietilenoglicol (PEG) foi usado na modificação não covalente e covalente da lacase sendo a sua performance posteriormente avaliada. A performance catalítica das diferentes lacases PEGiladas foi comparada em fase aquosa e em gel. Os resultados demonstram que a lacase modificada, quer de forma não-covalente ou covalente (lacase PEGilada), é capaz de promover a polimerização do catecol, aumentando quer o grau de conversão quer o grau de polimerização. No entanto, estes eventos foram unicamente detetados em fase aquosa. Os estudos de modelação molecular demonstram que a presença do PEG desacelera a desativação da enzima em fase aquosa. Posteriormente, foi efetuada a imobilização da lacase nativa e da lacase PEGilada em resina epoxy, usando polietilenoglicol como agente de ligação entre a enzima e o suporte. A performance de polimerização em fase aquosa das enzimas imobilizadas foi explorada e a estrutura dos polímeros obtidos foi proposta. Depois de imobilizada, o tempo de meia-vida da lacase foi incrementado assim como a sua estabilidade. A análise de MALDI-TOF MS revelou um aumento do grau de polimerização quando as enzimas imobilizadas, epoxy-lacase nativa, epoxy-PEGilada e epoxy-PEG-lacase, foram usadas como catalisador. Posteriormente, foram estudados diferentes reatores para a polimerização do catecol, nomeadamente banho termostatizado com agitação orbital, banho de ultrassons e homogeneizador de alta pressão. A atividade e estabilidade da lacase nesses reatores foram primeiramente avaliadas assim como o mecanismo de síntese do catecol em presença de ambientes de elevada energia. Os polímeros obtidos foram caracterizados sendo proposta a sua estrutura final. Os resultados demonstraram que ambientes de maior energia fornecem uma maior interação entre a enzima e o substrato, incrementando assim o rendimento de polimerização. O grau de conversão aquando da utilização quer do banho de ultrassons quer do homogeneizador de alta-pressão foi superior ao obtido quando a polimerização foi efetuada no banho termostatizado com agitação orbital. A lacase sob efeito de ultrassons ou do homogeneizador de alta pressão revelou menor estabilidade que quando sob o efeito do banho termostatizado. No entanto, dado que a polimerização ocorre antes dessa inativação, os ambientes de maior energia não provocam efeito negativo sobre a síntese do polímero. A performance catalítica das lacases, nativa, PEGilada e epóxi-PEGilada, foi avaliada quando sob o efeito do homogeneizador de alta pressão. Foi comparada a atividade e estabilidade assim como os correspondentes polímeros produzidos. As formas da lacase, PEGilada e Epoxi-PEGilada, revelaram a maior atividade catalítica assim como maior estabilidade. Em seguida, o catecol e a p-fenilenodiamina foram polimerizados no homogeneizador de alta-pressão pela lacase usando sacos feitos de poliéster (PET), algodão e lã que serviram de recipientes da enzima. A funcionalização dos tecidos foi conseguida através da polimerização in situ dos substratos aromáticos sobre os tecidos contendo a enzima. Ambos os polímeros, poli(catecol) e poli(p-fenilenodiamina), apresentam aceitável estabilidade dimensional e resistência à degradação térmica, assim como capacidade de eliminação de radicais livres. Foram obtidos polímeros com cor com capacidade de coloração dos tecidos usados. As observações efetuadas por microscópio eletrónico de varredura mostram uma distribuição uniforme do polímero na superfície dos tecidos de poliéster, algodão e lã, tendo os mesmos revelado alguma resistência à lavagem, à luz solar e à fricção. Os tecidos após funcionalização com poli(p-fenilenodiamina) revelaram condutividade elétrica. Ambos os polímeros produzidos foram capazes de conferir capacidade antimicrobiana aos tecidos com eles funcionalizados contra bactérias Gram positiva (S. aureus) e Gram negativa (E.coli). Ensaios de toxicidade efetuados nos tecidos funcionalizados revelaram que a difusão dos polímeros, depende da porosidade dos tecidos, e afeta diretamente a viabilidade celular, que pode ser aumentada ajustando a concentração do polímero. Este projeto visa o estudo do impacto da modificação da enzima e das condições de processamentos na estrutura dos produtos de reação com funções múltiplas, tendo ao mesmo tempo o objetivo de estabelecer um sistema reacional de catálise de uma panóplia de compostos fenólicos pela lacase. Os oligomeros e/ou polímeros produzidos poderão ter diferente aplicações em áreas como têxtil, médica, entre outras.