Development of a phage-based bioactive product to control biofilms in chronic wounds

Abstract

Chronic wounds are skin injuries where the normal healing process has failed and anatomical integrity is not achieved within a normal period. Worldwide, these wounds affect thousands of people, causing pain and discomfort. One of the difficulties on the healing of these wounds are the infections caused by biofilms. These polymicrobial aggregates cause serious infections, because they are persistent and highly tolerant to common therapies, namely the antibiotics. Very recently the World Health Organization published a list of priority pathogens resistant to antibiotics and emphasize the scientific community and pharmaceutical industries to focus on the development of new antimicrobials to combat these pathogens. The use of bacteriophages (phages) is seen as a possible novel treatment against antibiotic-resistant infections, namely in chronic wounds. Therefore, the aim of this work was to develop a phage-based bioactive product to be incorporated into a wound dressing to control biofilms in chronic wounds. To achieve that, the first step of this work was to isolate phages that specifically infect Escherichia coli, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis and Staphylococcus aureus strains. After this, phages were subjected to a process of characterization that consisted in, evaluation of their host range, in vitro studies, morphological/genomic analysis and temperature/pH stability studies. After isolating several phages, three were selected for an in-depth characterization: E. faecalis phages 09-2 and 80-2 and E. faecium phage C410. Reductions of about 2 orders-of-magnitude in biofilm cells, at 6 h were observed in in vitro assays, mainly when these were performed in the presence of culture media. The characterization process was also performed with the Collagen Wound Model and reductions between 1 and 2 orders-of-magnitude (p<0.05) were observed on 8 h post-treatment. When phages were combined to treat dual-species biofilms, the phage cocktail reduced the biofilm cells in about 2.5 orders-of-magnitude (p<0.05) at 3, 6 and 8 h, and in about 1 order-of-magnitude (p<0.05) at 24 h. These reductions were higher than any single phage application. All phages were stable after 24 h, between −20 and 37 °C, and in the pH range 5.0–11.0. Morphological and genomic features indicated that both E. faecalis phages are members of the family Siphoviridae, while E. faecium phage C410 is a member of the Podoviridae family. Although proteins with toxic potential were not identified on E. faecalis phage 80-2 and E. faecium phage C410 genomes, E. faecalis phage 09-2 needs a more detailed genomic analysis, due to the presence of the hemolysin XhlA family codifying gene. Furthermore, for the use of phages in therapy it is important to guarantee their safety. Therefore, phages solutions were purified using chromatographic approaches, namely CIMmultus® columns. However, the purest phage fraction has not been determined. Moreover, phages cytotoxic potential was also evaluated in a 3T3 cell line by Neutral Red Uptake test. The phage solutions presented no toxicity when used at a concentration of 107 PFU/mL. Finally, in order to evaluate the capability of phages to kill internalized bacteria, internalization studies were conducted in the same cell line. Bacterial reductions between 2 and 3 orders-of-magnitude (p<0.05) were observed in phage-treated cells, showing that the studied phages can infect internalized bacteria. In conclusion, in this work, phages capable of killing enterococci were well characterized, and therefore their use in a phage-based product may be possible. These phages showed to be non-toxic and efficient for controlling the internalized bacteria in animal cells, thus exhibiting a great potential to be incorporated in a bioactive dressing to treat chronic wounds.

Feridas crónicas são lesões na pele, onde o processo normal de cicatrização falhou e a integridade anatómica não é alcançada num período normal. Em todo o mundo, estas feridas afectam milhares de pessoas causando dor e desconforto. Uma das dificuldades na cicatrização das feridas crónicas são as infeções causadas por biofilmes. Estes agregados polimicrobianos causam graves infeções, devido à sua persistência e por possuírem elevada tolerância a terapias comuns, nomeadamente a antibióticos. Muito recentemente a Organização Mundial de Saúde publicou uma lista de patogénicos prioritários resistentes aos antibióticos e incentivou a comunidade científica e a indústria farmacêutica a focarem-se no desenvolvimento de novos antimicrobianos, para o combate destes patogénicos. O uso de bacteriófagos (fagos) é visto como um possível novo tratamento no combate a infeções resistentes a antibióticos, nomeadamente em feridas crónicas. Assim sendo, o objetivo principal deste trabalho foi desenvolver um produto bioativo com fagos para ser incorporado num penso, de modo a controlar infeções por biofilmes em feridas crónicas. Para atingir o objetivo, o primeiro passo foi isolar fagos que infetam especificamente estirpes de Escherichia coli, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis e Staphylococcus aureus. Após o isolamento, os fagos foram sujeitos a um processo de caracterização que consistiu na avaliação da sua gama de hospedeiros, estudos in vitro, análise morfológica/genómica e estudos de estabilidade à temperatura/pH. Três fagos foram selecionados para uma caracterização mais profunda: os fagos 09-2 e 80-2 de E. faecalis e o fago C410 de E. faecium. Após 6 horas de contacto com fagos, foram observadas reduções de cerca de 2 ordens-de-magnitude, em células de biofilme, principalmente quando estes ensaios foram realizados na presença de meio de cultura. O processo de caracterização foi também realizado através do modelo “Collagen Wound Model” e neste, foram observadas reduções entre 1 e 2 ordens-de-magnitude (p<0.05), 8 horas pós-tratamento. Quando os fagos foram combinados para tratar biofilmes de duas espécies, o cocktail de fagos reduziu as células do biofilme em cerca de 2.5 ordens-de-magnitude (p<0.05) às 3, 6 e 8 horas, e em cerca de 1 ordem-de-magnitude (p<0.05) às 24 horas. Estas reduções foram maiores do que em qualquer aplicação de apenas o fago de uma espécie. Todos os fagos apresentaram estabilidade entre -20 e 37 ºC e na gama de pH 5.0-11.0, até 24 horas. As características morfológicas e genómicas indicaram que ambos os fagos de E. faecalis são membros da família Siphoviridae, enquanto o fago C410 de E. faecium é membro da família Podoviridae. Apesar de não terem sido identificadas proteínas com potencial tóxico no fago 80-2 de E. faecalis e no fago C410 de E. faecium, o fago 09-2 de E. faecalis requer uma análise genómica mais detalhada, devido à presença do gene de codificação da família de hemolisina XhlA. Adicionalmente, para que a utilização de fagos como terapia seja possível é importante avaliar a sua segurança. Portanto, as soluções de fago foram purificadas usando abordagens cromatográficas, nomeadamente colunas CIMmultus®. Contudo, a fração de fago mais pura não foi determinada. O potencial citotóxico dos fagos foi também avaliado na linha celular de fibroblastos 3T3 através do teste “Neutral Red Uptake”. As soluções de fago, 107 PFU/mL não apresentaram toxicidade. Por último, para avaliar a capacidade dos fagos para matar bactérias internalizadas, foram realizados estudos de internalização na mesma linha celular. Observou-se reduções bacterianas entre 2 e 3 ordens-de-magnitude (p<0.05) em células tratadas com fagos, mostrando que os fagos estudados podem infectar bactérias internalizadas. Em conclusão, os fagos E. faecalis 09-2, 80-2 e E. faecium C410, capazes de matar enterococci foram isolados e bem caracterizados e, portanto, o seu uso num produto baseado em fagos, pode ser possível. Estes fagos mostraram ser não tóxicos e eficientes no controlo de bactérias internalizadas em células animais, apresentando, portanto, um grande potencial para serem incorporados num penso para tratar feridas crónicas.