New insights on Retinoic Acid Signaling-Metabolism interaction during lung branching morphogenesis

Abstract

A ramificação pulmonar é um processo complexo caracterizado por interações epitélio-mesênquima e coordenado por vias de sinalização que contribuem para a formação das vias respiratórias. A via de sinalização do Ácido Retinoico (AR) é crucial para o desenvolvimento pulmonar e é particularmente importante para o padrão próximo-distal e a ramificação pulmonar. Os mecanismos moleculares subjacentes aos estadios iniciais do desenvolvimento pulmonar estão bem explorados, no entanto, ainda pouco se sabe quanto ao metabolismo do pulmão embrionário. Existem evidências que sugerem que as interações entre sinalização e metabolismo são essenciais para perceber os processos de desenvolvimento embrionário. O principal objetivo desta tese foi investigar o perfil metabólico associado aos estadios iniciais da ramificação pulmonar e estudar as potenciais interações entre a via de sinalização do Ácido Retinoico e o metabolismo associados à ramificação pulmonar. Na nossa abordagem utilizamos um sistema de cultura de explantes que nos permitiu mimetizar o processo de ramificação pulmonar, usando como modelo o embrião de galinha. O metabolismo associado à ramificação pulmonar foi avaliado aos níveis de transcrito, proteína e metabolitos, através de qPCR, hibridização in situ, western blot e espectroscopia de 1 H-RMN. Os níveis de proliferação foram avaliados através de um ensaio de EdU. A função mitocondrial e capacidade respiratória dos pulmões foram analisadas através de ensaios de elétrodo Clark e Seahorse. Neste estudo descrevemos as alterações metabólicas que ocorrem ao longo do tempo e acompanham o processo de ramificação pulmonar. À medida que a ramificação pulmonar progride, o pulmão adapta-se a um metabolismo glicolítico com produção de lactato e que se assemelha ao metabolismo do tipo Warburg. Mais ainda, a modulação da via de sinalização do AR regula o metabolismo pulmonar. A estimulação da via do AR aumenta a ramificação pulmonar promovendo condições ótimas de crescimento. Por outro lado, a inibição da via do AR parece induzir um metabolismo menos eficiente e que está associado a um fenótipo pulmonar anormal. Em suma, demonstramos que o desenvolvimento pulmonar e o metabolismo estão interligados e descrevemos novas noções sobre a interação entre a sinalização e o metabolismo. Neste estudo destacamos ainda a importância da regulação metabólica durante a ramificação pulmonar e como a sinalização e o metabolismo devem ser controlados por forma a evitar o comprometimento do crescimento pulmonar.

Lung branching morphogenesis is a complex process characterized by epithelial-mesenchymal interactions and coordinated by signaling networks that ultimately define the airway conducting system. Retinoic Acid (RA) signaling is a major player in lung development and is particularly important for proximal-distal patterning and branching morphogenesis. The molecular mechanisms involved in early lung development are well explored. However, little is known concerning embryonic lung metabolism. Moreover, growing evidence suggests that signaling-metabolism interactions are essential to understanding developmental processes. The main goal of this thesis was to investigate the metabolic profile associated with the early stages of pulmonary branching and to study potential interactions between the Retinoic Acid signaling pathway and the lung branching metabolism. In our approach, we performed an explant culture system to mimic the process of lung branching morphogenesis and used the chicken embryo as a model. Lung branching metabolism was assessed at the transcript, protein, and metabolite levels by qPCR, in situ hybridization, western blot, and 1 H-NMR spectroscopy. The proliferation status was assessed using an EdU-based assay. Mitochondrial function and the lung respiratory capacity were studied using a Clark-type electrode and a Seahorse analysis. In this study, we described the temporal metabolic changes accompanying early lung branching morphogenesis. As pulmonary branching proceeds, the lung progressively adapts to a glycolytic lactate-based metabolic profile that resembles a Warburg-like metabolism. Moreover, RA signaling modulation regulates lung branching metabolism. While RA signaling stimulation increases lung branching by promoting optimal growth conditions, RA signaling inhibition seems to induce a less efficient metabolism associated with a disease like phenotype. In conclusion, we unveiled that lung development and metabolism are interlinked, and we brought novel insights on the signaling-metabolism interaction. This work highlights the importance of metabolic regulation during lung branching morphogenesis and how signaling and metabolism must be finely tuned to prevent lung growth impairment.