The study of human copper transporters using advanced microscopy techniques

Abstract

O cobre (Cu) é encontrado em todos os organismos vivos nos estados de Cu oxidado (II) e Cu (I) reduzido. Cu é um metal essencial para a sobrevivência das células e desempenha um papel vital como cofator catalítico em reações de oxirredução, envolvendo várias proteínas que desempenham funções fisiológicas essenciais. A regulação da aquisição de cobre, por parte dos organismos, é de extrema importância, devido à sua capacidade em gerar, nos ciclos de reações de oxidação-redução, radicais livres intracelulares prejudiciais, que podem ser tóxicos. A nível celular, o cobre entra nas células através de proteínas transportadoras situadas na membrana plasmática. Nos seres humanos, existem dois principais transportadores de cobre, denominados human copper transporter 1 (hCtr1) e human copper transporter 2 (hCtr2). Neste trabalho foram construídos plasmídeos com as sequências de DNA CTR1 e CTR2, fundidas com genes de proteínas fluorescentes. Estes constituem ferramentas essenciais para estudos futuros sobre a expressão e o tráfego dos Ctrs. Com o intuito de encontrar as melhores condições de expressão dos plasmídeos construídos, foram testadas diferentes linhas celulares humanas. Noutro capítulo, avaliou-se como a disponibilidade de cobre afeta a trimerização do hCtr1 e investigou-se também uma possível interação entre hCtr1 e hCtr2; foram também executadas Técnicas de Number and Brightness (N&B) e Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), neste contexto. Os resultados obtidos sugerem que, na presença de BCS, um quelante impermeável de cobre, hCtr1 não é significativamente afetado e, a sua trimerização não aumenta, quando comparada com o grupo de células não tratadas. Estes estudos abriram o caminho para novos desenvolvimentos, que incluem testar diferentes concentrações de BCS e o uso de um quelante intracelular de cobre. Relativamente à interação entre hCtr1 e hCtr2, os resultados obtidos indicam que não houve ocorrência de FRET, pese embora, ter sido observada alguma colocalização em vesículas intracelulares. No geral, este trabalho resultou na construção de ferramentas relevantes de biologia molecular e, em novas ideias, sobre como podemos usar técnicas, tais como N&B e FRET, para o estudo da mecanismos dinâmicos e expressão de transportadores de cobre.

Copper (Cu) is found in all living organisms both in the oxidized Cu(II) and in the reduced Cu(I) states. It is essential for survival and plays a vital role as a catalytic cofactor in redox chemistry for a variety of proteins that carry out key physiological functions. Organisms must tightly regulate copper acquisition because redox cycling of Cu can generate damaging intracellular free radicals, which can be toxic. Although the major proteins involved in copper uptake in mammalian cells have been identified, many details regarding their mechanisms of function and regulation are still missing. At the cellular level, copper enters the cell via plasma membrane transport proteins. In humans there are two main copper transporters, named human copper transporter 1 (hCtr1) and human copper transporter 2 (hCtr2). In this work, several plasmids harbouring CTR1 or CTR2 transporter genes, fused with fluorescent proteins, were generated. These are essential tools for future studies on Ctrs’ expression and trafficking. Also, different human cell lines were tested, in order to find the best expression conditions. Additionally, we evaluated how copper availability affects hCtr1 trimerization and we also assessed a possible interaction between hCtr1 and hCtr2. Number and Brightness (N&B) and Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) techniques were carried out within these tasks. The results obtained suggest that in the presence of BCS, an impermeable copper chelator, human copper transporter 1 is not significantly affected and its trimerization does not increase when compared to nontreated cells. These studies paved the way for further developments, that include testing different BCS concentrations and the use of an intracellular copper chelator. Regarding hCtr1 and hCtr2 interaction, the obtained results indicate that FRET did not occur, although some colocalization was observed in inner vesicles. Therefore, we couldn’t draw conclusions on the interaction between these two transporters. In the meantime, we have generated pGFP-CTR1 construct which will allow us to test FRET with copper transporters harbouring GFP or mCherry, at the same terminals of hCtr1 and hCtr2, respectively. Overall, this work resulted in the generation of relevant molecular biology tools and in new insights into how we can use techniques such as N&B and FRET to the study of copper transporters dynamics and expression.