Novos análogos de purina como candidatos a sondas fluorescentes para sistemas biológicos

Abstract

A 2-aminopurina (2AP) tem sido uma das moléculas mais utilizadas como sonda fluorescente, devido à sua elevada fluorescência em soluções neutras e ao decréscimo elevado dessa fluorescência quando incorporada nos ácidos nucleicos. Contudo, os métodos utilizados para síntese da 2AP não são simples e a necessidade de encontrar novos análogos, com propriedades fotofísicas melhoradas e métodos de síntese mais eficientes, continua a ser um desafio para a comunidade científica. Neste trabalho realizou-se a síntese de análogos à 2AP numa sequência reacional de quatro etapas e a partir de reagentes comerciais simples e acessíveis. O trabalho experimental iniciou-se com a reação entre o diaminomaleonitrilo e o ortoformiato de etilo para formar o N-[(Z)-2-amino-1,2-dicianovinil] formimidato de etilo, que é o primeiro reagente de partida do processo. Posteriormente fez-se reagir este imidato com aminas primárias alquílicas e arílicas para formar os 5-amino-4-cianoformimidoilimidazoles numa sequência reacional de duas etapas. Uma vez obtidos os correspondentes N 1 -alquil e N 1 -aril imidazoles, realizou-se a reação destes intermediários com cianamida para obter os 5-amino-N cianoimidazole-4-carbimidoilnitrilos por adição nucleofílica ao carbono imínico do grupo 4- cianoformimidoílo, seguida de eliminação de HCN. Por fim, converteram-se estes 5-amino-N cianoimidazole-4-carbimidoilnitrilos em 2-aminopurina-6-carbonitrilos, os análogos à 2AP que constituem as moléculas alvo deste projeto. Após a síntese dos 2-aminopurina-6-carbonitrilos, estudou-se as condições reacionais para a modificação na posição 6 destas purinas, de modo a obter outros derivados de purina fluorescentes. Adicionalmente, foi sintetizada um nova estrutura de pirimidina, que também demonstrou propriedades fluorescentes e, portanto, investigaram-se as melhores condições reacionais para a sua síntese. Na etapa final do trabalho, procedeu-se à caracterização fotofísica das purinas sintetizadas em diferentes solventes (diclorometano, dioxano, acetonitrilo e etanol) e soluções tampão com diferentes valores de pH (pH=7,3 e 5,6). Avaliaram-se as propriedades fotofísicas, nomeadamente a absorção no UV/visível e a emissão de fluorescência, de cada solução preparada, que foram comparadas com as do seu análogo 2AP. Além disso, à semelhança das purinas, foi realizado o estudo das propriedades fotofísicas da nova molécula e ainda se realizaram medidas de fluorescência em membranas modelo, para inferir a possibilidade de o composto ser usado como sonda de biomembranas. Verificou-se que alguns dos análogos possuem propriedades muito promissoras, tais como um elevado rendimento quântico de fluorescência, um desvio de Stokes apreciável e uma emissão sensível à polaridade do meio em que a molécula se encontra.

2-Aminopurine (2AP) has been one of the most used molecules as a fluorescent probe, due to its high fluorescence in neutral solutions and the high decrease in fluorescence when incorporated into nucleic acids. However, the methods used for the synthesis of 2AP are not simple and the need to find new analogues, with improved photophysical properties and more efficient synthesis methods, remains a challenge for the scientific community. In this work, the synthesis of 2AP analogues was carried out in a reaction sequence of four steps and from simple and accessible commercial reagents. The experimental work began with the reaction between diaminomaleonitrile and ethyl orthoformate to form ethyl N-[(Z)-2-amino-1,2-dicyanovinyl] formimidate, which is the first reagent of the work. Then this imidate reacted with primary alkyl and aryl amines to form the 5-amino-4-cyanoformimidoylimidazoles in a two-step reaction sequence. Once the corresponding N 1 -alkyl and N 1 -aryl imidazoles were obtained, these intermediates were reacted with cyanamide to obtain the 5-amino-N-cyanoimidazole-4-carbimidoylnitriles by nucleophilic addition to the imine carbon of 4-cyanoformimidoyl group, followed by elimination of HCN. Finally, these 5-amino-N cyanoimidazole-4-carbimidoylnitriles were converted into 2-aminopurine-6-carbonitriles, the 2AP analogues that constitute the target molecules of this project. After the synthesis of 2-aminopurine-6- carbonitriles, the reaction conditions for the modification in position 6 of these purines were studied, in order to obtain other fluorescent purine derivatives. Additionally, a new pyrimidine structure was synthesized, which also demonstrated fluorescent properties and, therefore, the best reaction conditions for its synthesis were investigated. In the final stage of the work, the photophysical characterization of the synthesized purines in different solvents (dichloromethane, dioxane, acetonitrile and ethanol) and buffer solutions with different pH values (pH=7.3 and 5.6) was carried out. The photophysical properties, namely UV/visible absorption and fluorescence emission, of each prepared solution were evaluated and compared with those of 2AP analogue. In addition, similarly to purines, the study of the photophysical properties of the new pyrimidine molecule was carried out and fluorescence measurements were also carried out in model membranes, to infer the possibility of using this compound as a biomembrane probe. Some of the analogues were found to have very promising properties, such as a high quantum yield of fluorescence, an appreciable Stokes shift and an emission sensitive to the polarity of the medium in which the molecule finds itself.