Fetal lung macrophage-derived secretome in the modulation of lung differentiation

Abstract

A prematuridade está associada a uma elevada taxa de mortalidade de recém-nascidos prematuros, principalmente devido ao desenvolvimento pulmonar incompleto, o que leva à insuficiência respiratória. As terapias atualmente disponíveis têm revelado estarem associadas a várias consequências a longo prazo. Assim, é crucial desvendar novos alvos terapêuticos alternativos de forma a melhorar a diferenciação e a maturação pulmonar. Os macrófagos tecidulares são classificados como células fagocíticas que exibem vários papéis imunológicos, como, por exemplo, identificação e destruição de patogéneos. Além disso, a interação de macrófagos com o ambiente circundante conduz à sua ativação como um mecanismo efetor para a imunidade mediada por células. Uma melhor compreensão da heterogeneidade de macrófagos revelou a sua importância em funções não imunes, tais como moduladores cruciais de processos de desenvolvimento, como a morfogênese por ramificação e diferenciação celular, e também a manutenção da homeostasia de tecidos. O grupo descobriu que os macrófagos do tecido pulmonar fetal (MPf) são intervenientes cruciais na modulação da fase sacular do desenvolvimento normal do pulmão, sendo que a sua ausência leva a distúrbios na morfologia sacular pulmonar e comprometimentos na diferenciação de linhagens alveolares e estromais. A hipótese de que as funções dos macrófagos tecidulares no desenvolvimento pulmonar são realizadas através de fatores parácrinos, combinados com as atuais terapias isentas de células, levou-nos a investigar os efeitos do secretoma de MPf na fase sacular do desenvolvimento pulmonar. Para isso, uma cultura primária de MPf foi estabelecida no dia embrionário 17,5 e por separação imunomagnética foi feito o isolamento dos MPf. A viabilidade celular foi demonstrada e o fenótipo macrófagico foi confirmado por citometria de fluxo e imunofluorescência. Dados de RT-qPCR revelaram um fenótipo de ativação misto M1/M2 e um possível perfil específico do pulmão fetal. Para entender os efeitos do secretoma derivado do MPf na saculação e diferenciação pulmonar, foi utilizado o modelo de cortes finos de precisão de pulmão fetal (CFPPf) desafiado com o meio condicionado (MC) derivado de MPf. A quantificação da área de espaço aéreo-alveolar apontou o secretoma derivado do MPf como um indutor de saculação pulmonar. Cortes tratados com MC de MPf também mostraram aumento da proliferação geral e uma clara associação com a expansão de uma população de células progenitoras alveolares bipotentes. As descobertas feitas nesta tese indicam que os macrófagos pulmonares fetais apresentam uma capacidade de sinalização parácrina única, crítica para a saculação e diferenciação pulmonar.

Prematurity is associated with a high mortality rate of preterm newborns, mainly due to incomplete lung development, which leads to respiratory insufficiency. Furthermore, the currently available therapy has been shown to have several long-term consequences. Thus, it is crucial to unravel new alternative therapeutic targets to improve lung differentiation and maturation. Tissue macrophages are classified as phagocytic cells that display several immune roles, such as identifying and engulfing pathogens. Moreover, macrophage interaction with the surrounding environment conducts to their activation as an effector mechanism for cell-mediated immunity. A better understanding of macrophage heterogeneity revealed their importance in non-immune functions, such as crucial modulators of developmental processes, branching morphogenesis and cellular differentiation, and tissue homeostasis and repair maintenance. Our group uncovered that fetal lung tissue macrophages(fLMo) are crucial players in orchestrating the saccular stage of normal lung development, whereas their absence leads to disturbances in lung saccular morphology and impairments in alveolar epithelial and stromal cell lineages differentiation. The potential that tissue macrophages functions in lung formation are accomplished through paracrine factors, combined with the promising potential of cell-free-based therapies, led us to investigate fLMo secretome effects in the lung developmental saccular stage. A fLMo primary culture was established at embryonic day 17.5 using magnetic cell sorting for macrophage separation. The cell viability was demonstrated, and the macrophagic phenotype was confirmed by flow cytometry (FC) and immunofluorescence (IF). RT-qPCR data revealed a mixed M1/M2-like activated phenotype and a probable fetal lung-specific profile in cultured fLMo. To understand the effects of fLMo derived secretome on lung sacculation and differentiation, the fetal precision-cut lung slices (PCLS) model was used and challenged with fLMo-derived conditioned medium (CM). The quantification of the alveolar airspace area pointed to the fLMo-derived secretome as an inducer of overall lung sacculation. fLMo treated slices also showed increased overall proliferation and a clear association with expanding a bipotent progenitor cell population. These thesis findings indicate that fetal lung macrophages present a unique paracrine signalling ability critical to lung sacculation and differentiation.