Influence of HOXA9 in the response of glioblastoma to immune checkpoint inhibitors

Abstract

Glioblastoma (GBM) is the most common and malignant primary central nervous system (CNS) tumour in adults, characterized by high resistance to conventional therapies and a very poor outcome, with a median survival of 15 months. GBM is a highly immunosuppressive tumour, with mechanisms to promote tumour escape from the immune system. Its microenvironment is characterized by the presence of cytokines that inhibit the immune system by suppressing T-cell activation and proliferation, and skewing the immune cells towards a pro-tumour phenotype. Additionally, GBM cells frequently overexpress programmed cell death ligand 1 (PD-L1), an immune checkpoint ligand that binds to programmed cell death 1 (PD1) present in activated T-cells. Recently, immunotherapies using immune checkpoint inhibitors (ICIs) have gained importance by showing promising results in treatment of various cancers. Previous studies showed that HOXA9, a critical transcription factor deregulated in gliomas, is critical in resistance to standard chemotherapy, and global aggressiveness of GBM. Moreover, HOXA9 down regulates mechanisms related to antigen processing and presentation, and to immune responses. This project aims to decipher the relevance of HOXA9 in the immune evasion in GBM, both in treatment-naïve conditions and under ICIs therapy. For this, HOXA9 over-expression and silencing models of human GBM cell lines were used, to understand whether HOXA9 expression modulates the expression of cytokines and of immune checkpoint ligands, and how it influences T-cell responses in the presence or absence of ICIs. Results with human GBM cell lines suggest that expression of HOXA9 is associated with differential expression of immune related cytokines: namely inversely associates with IL1B expression; and with IL8 expression in GL18 cell line; and also associated with CCL2 expression in U251 cell line. At protein level, the silencing of HOXA9 leads to a decrease in PD-L1 expression and to an increase in the PD-L2 expression in the membrane of U251 cells. Moreover, a minor but significant increased sensitivity to anti PD1 therapy is observed in U251 cells, but not in the other cell lines (U87 and U251). Regarding T-cell survival and subpopulations, namely Tregs, no significant differences were obtained. Overall, this work suggests that HOXA9 might increase immunosuppression in GBM, and that a partially effective immune response against GBM cell lines seems to exist. To further complement and clarify these results, it is essential to evaluate the secretion of these cytokines and chemokine; and to extend this study, in vivo GBM models could clarify the roles of HOXA9 in immune cells infiltration and in survival of mice in treatment-naïve conditions or upon treatment with ICIs.

O glioblastoma (GBM) é o tumor primário mais comum e maligno do sistema nervoso central em adultos, caracterizando-se por uma elevada resistência às terapias convencionais e por um mau prognóstico, com uma sobrevivência mediana de 15 meses. O GBM é muito imunossupressor, com mecanismos para promover a evasão do sistema imunitário. O seu microambiente tumoral é caracterizado pela presença de citocinas que inibem o sistema imunitário, suprimindo a ativação e proliferação das células T e alterando as células imunes para um fenótipo pro-tumoral. Adicionalmente, as células de GBM sobre expressam frequentemente o “programmed cell death ligand 1” (PD-L1), que se liga ao “programmed cell death 1” (PD1) presente nas células T. Recentemente, imunoterapias que usam inibidores de “checkpoints” imunes (ICIs) ganharam extrema importância, pois mostraram resultados promissores no tratamento de vários cancros. Estudos prévios mostram que o HOXA9, um crítico fator de transcrição desregulado em gliomas, é muito importante na resistência à terapia convencional e na agressividade global do GBM, regulando, ainda, negativamente mecanismos relacionados com o processamento e apresentação de antigénios e com respostas imunes. Este projeto tem como objetivo compreender a importância do HOXA9 na evasão do sistema imunitário no GBM, com e sem ICIs. Para tal, foram usados modelos de sobre-expressão e de silenciamento do HOXA9 de linhas celulares de GBM humanas para perceber se a expressão do HOXA9 modula a expressão de citocinas e de ligandos de “checkpoints” imunes e qual a sua influência na resposta das células T, com ou sem ICIs. Os resultados com as linhas celulares de GBM humanas sugerem que a expressão do HOXA9 está associada a uma diferente expressão de citocinas relacionadas com o sistema imunitário. Assim, está inversamente associada à expressão de IL1B e de IL8 na linha celular GL18 e diretamente associada à expressão de CCL2 na linha celular U251. A nível proteico, o silenciamento do HOXA9 leva à diminuição da expressão de PD-L1 e ao aumento da expressão de PD-L2 na membrana das células U251. Além disso, foi observado um pequeno, mas significativo, aumento da sensibilidade à terapia com anti-PD1 nas células U251, mas estes efeitos não foram observados nas linhas celulares U87 e GL18. Em relação à sobrevivência e subpopulações de células T, nomeadamente Tregs, não foram obtidas diferenças significativas. No geral, estes resultados sugerem que o HOXA9 pode aumentar a imunossupressão no GBM e que parece existir uma resposta imune parcial contra as linhas celulares de GBM. Para complementar e clarificar estes resultados, é essencial avaliar a secreção destas citocinas e da quimiocina. Os modelos in vivo podem clarificar o papel do HOXA9 na infiltração de células imunes e na sobrevivência dos ratinhos, com e sem ICIs.