Metabolic biomarkers of chick embryonic lung development: impact of retinoic acid

Abstract

Pulmonary development is a complex process that depends on the activation of conserved signaling pathways that regulate cellular processes such as proliferation, differentiation and migration. Retinoic acid (RA) signaling is one of the active pathways during lung organogenesis, since it modulates branching morphogenesis in a dose-dependent manner. It is widely accepted that the cellular events underlying embryonic development require high amounts of energy and nutrients to form new biomass. However, the metabolic changes that occur during lung branching morphogenesis have not been described so far. In this work, we have characterized, for the first time, the metabolic profile of chick lung branching in early stages of development: b1, b2 and b3 (1, 2 or 3 secondary bronchi, respectively). Furthermore, the impact of RA on lung branching metabolism was evaluated. Ex vivo lung explant culture was performed in the presence or absence of RA, and the medium collected to analyze the production/consumption of metabolites associated with glucose catabolism (glucose, lactate, acetate, alanine), by 1 H-NMR. qRT-PCR and in situ hybridization were performed to assess the expression levels and patterns of key enzymes and transporters from glucose catabolic pathway. In normal conditions, the major metabolite variations occur from stage b1 to stage b3. In b3, there is an increase in lactate and acetate production. Still, glucose consumption is maintained from b1 to b3 stage with a concurrent decrease of glucose transporter 3 (glut3) transcript levels, and a decrease in hexokinase 1 (hk1) levels in b3 stage. This phenomenon suggests an increase in the glycolytic efficiency and a shift to lactate production. In fact, we observed a decrease on pyruvate dehydrogenase B (pdhb) and an increase in lactate dehydrogenase A (ldha) expression levels in b3 stage, while lactate dehydrogenase B (ldhb) levels decrease. Embryonic lung expression pattern of glut3, hk1, ldha, ldhb and pdha were characterized suggesting hypothetical interactions between the mesenchymal and epithelial compartments. When b2 lung explants were exposed to RA, glucose consumption, alanine and lactate production decreased. On the other hand, glutamate, glutamine consumption, and acetate production remain unaltered whereas pyruvate production increased. This phenomenon is accompanied by an increase in ldha expression levels. This study describes, for the first time, the temporal metabolic changes associated with chick pulmonary branching. It seems that glycolytic efficiency is increased, with a concurrent metabolic shift from Krebs cycle to lactate production. Furthermore, acetate and lactate are potentially seen as metabolic biomarkers of lung development. On the other hand, RA triggers a metabolic shift where lipids may be potentially seen as source of carbons and energy during RA-induced branching morphogenesis.

O desenvolvimento pulmonar é um processo complexo que depende da ativação de vias de sinalização conservadas que regulam diversos processos celulares, nomeadamente proliferação, diferenciação e migração. A via de sinalização do ácido retinoico é uma das vias cruciais na morfogénese pulmonar uma vez que modula a ramificação pulmonar. Sabe-se que durante o desenvolvimento embrionário são necessárias elevadas quantidades de energia e nutrientes para formação de biomassa. No entanto, as alterações metabólicas que ocorrem ao longo do processo de ramificação pulmonar ainda não foram descritas. Neste trabalho, caracterizamos, pela primeira vez, o perfil metabólico da ramificação pulmonar de galinha, em estadios precoces do desenvolvimento: b1, b2 e b3 (1, 2 ou 3 brônquios secundários, respetivamente). Adicionalmente, descrevemos o impacto do ácido retinoico sobre o metabolismo durante a ramificação pulmonar. Realizaram-se cultura de explantes pulmonares em condições normais e na presença de ácido retinoico; os meios de cultura foram analisados, por 1 H-NMR, para determinar a produção/consumo de metabolitos associados ao catabolismo da glucose (glucose, lactato, acetato, alanina). O padrão e os níveis expressão de transcritos de enzimas e transportadores implicados no catabolismo da glucose foram analisados por hibridização in situ e qRT-PCR, respetivamente. O padrão de expressão de glut3, hk1, ldha, ldhb e pdha sugere potenciais interações entre o mesênquima e epitélio pulmonar. A nível de metabolitos, as maiores variações ocorrem entre o estadio b1 e o estadio b3, em condições normais. Em b3, há um aumento da produção de lactato e acetato. No entanto, o consumo de glucose mantém-se de b1 para b3, havendo uma diminuição dos níveis de expressão do transportador de glucose 3 (glut3) e da hexoquinase 1 (hk1) em b3. Este fenómeno sugere um aumento da eficiência glicolítica e uma alteração para um metabolismo que resulta na produção de lactato. Na verdade, verifica se uma diminuição dos níveis de expressão da piruvato desidrogenase B (pdhb) e aumento dos níveis de expressão da lactato desidrogenase A (ldha) no estadio b3, enquanto que os níveis de lactato desidrogenase B (ldhb) diminuem. Quando explantes de pulmões b2 foram expostos, in vitro, a ácido retinoico, o consumo de glucose e produção de alanina e lactato diminuíram. Por outro lado, o consumo de glutamato e de glutamina, bem como a produção de acetato permaneceram inalterados, com um aumento da produção de piruvato. Este fenómeno foi acompanhado por um aumento da expressão de ldha. Neste estudo, são descritas, pela primeira vez, as alterações metabólicas que ocorrem ao longo do tempo, associadas ao processo de ramificação pulmonar de galinha. Durante o processo, a eficiência glicolítica está aumentada e parece haver uma alteração do metabolismo baseado no ciclo de Krebs para o metabolismo de produção de lactato. Assim, o acetato e o lactato são potencialmente biomarcadores do processo de desenvolvimento pulmonar. Por outro lado, o ácido retinoico estimula uma alteração metabólica sendo que os lipídios surgem como fonte de carbono e energia plausível que acompanha a ramificação pulmonar induzida pelo ácido retinoico.