The role of fungi in drinking water biofilm formation and behavior

Abstract

Drinking Water Distribution Systems (DWDS) is essential for the delivery of high-quality and safe drinking water (DW). However, DWDS allows the establishment of a dynamic microbiological ecosystem, where microorganisms are present in both planktonic and biofilm states. Microorganisms adhered to the surfaces of pipes are dominant. A biofilm can be defined as a sessile community of microorganisms irreversibly attached to a surface or substratum and each other, which are embedded in an extracellular polymeric substances (EPS) matrix that they produce and excrete. The biofilms formed in a DWDS are an interkingdom complex community since under natural conditions is rare the formation of monospecies biofilms. This diversity leads to a multiplicity of complex relationships involving intraspecies and interspecies interactions. In addition, biofilm formation in DWDS can be affected by a variety of biotic and abiotic factors, namely: environmental factors (temperature, pH), residual concentration of disinfectant, type and availability of nutrients, hydrodynamic conditions, design of the network, pipe material and sediment accumulation. The control of biofilm formation in DWDS is essential to make sure that the water delivered to the consumer is microbiologically safe. In this work, six different fungi were first evaluated in terms of growth kinetics and biofilm formation. The six fungi were: P. expansum, P. brevicompactum, F. oxysporum, A. versicolor, Alternaria sp, and Mucor sp. A stock of spore suspension of each fungus was made, and the biofilm assay was executed. For biofilm formation, 200 µL of spore suspension R2B was added into each well and spectrophotometric-based methods (crystal violet method for biomass quantification and resazurin method for metabolic activity quantification) were used to monitor the biofilm formation over time. Macro and Microscopic characterization were also performed for each fungus. In the end, the fungus which presented higher biomass formation and metabolic activity was Alternaria sp., and the values were 20.070 ± 3.825 and 3695.625 ± 802.910, respectively. This fungus was chosen for further studies to understand its behavior under different process conditions. The conditions chosen were the hydrodynamics, the nutrient concentration, the presence of chlorine, and an interkingdom association. Relative to the hydrodynamics, four conditions were evaluated (static, 30, 150, and 200 rpm). After three days of incubation, some significant differences between conditions were observed. The use of 200 rpm caused a significant difference (ρ<0,05) compared to the static and 30 rpm conditions, meaning that high rotations might influence the fungus growth and metabolic activity. In this condition, there was an increase in biomass and metabolic activity, suggesting that the high rotations had a positive influence. Comparative to the nutrient’s concentration, four different conditions were evaluated (synthetic tap water, ¼ R2B, ½ R2B, and R2B medium). After three days of incubation, that was observed that STW caused significant differences (ρ<0,05) compared to the others, meaning that the oligotrophic environment influences the fungus growth and metabolic activity negatively. The exposure to chlorine was studied under 5 conditions (without chlorine, 2,4 ppm, 6,03 ppm, 12,06 ppm, 24,12 ppm) and revealed no significant impact of the chlorine levels in biofilm formation and activity, suggesting the fungi resistance to chlorine. For the interkingdom factor, a strain of Stenotrophomonas maltophilia was used. Three assays were performed (Fungus and bacterium alone and associated). The results revealed that microbial association affected biofilm formation and activity, showing a decrease in biomass and metabolic activity compared to the fungi assay alone. Lastly, the species identification of two fungi used in this work was executed as well. The Alternaria sp. and Mucor sp. were the fungi that were not previously identified until the species group. For this identification, the fungi were incubated in R2B medium, and the DNA was extracted. After running some tests, such as the NanoDrop, the electrophoresis gel of the sample, and PCR cycle, the Fungi DNA was sequenced. Then, a phylogenetic tree was created based on the genetic sequences, with the same genetic marker (ITS), of different fungi species related to the samples. Thus, the phylogeny tree of the Mucor seems to direct the Mucor sp. toward the Mucor plumbeus and the phylogeny tree of the Alternaria put the sample in the Alternata section.

Os Sistemas de Distribuição de Água Potável (DWDS) são essenciais para o fornecimento de água potável de alta qualidade e segura (DW). Contudo, os DWDS permitem o estabelecimento de um ecossistema microbiológico dinâmico, onde os microrganismos estão presentes tanto em estados planctónicos como de biofilme. Os microrganismos aderidos nas superfícies das tubagens são dominantes. Um biofilme pode ser definido como uma comunidade séssil de microrganismos irreversivelmente ligados a uma superfície ou substrato e uns aos outros, que estão embutidos numa matriz extracelular de substâncias poliméricas (EPS) que produzem e excretam. Os biofilmes formados numa DWDS são uma comunidade complexa do interreino, uma vez que em condições naturais é rara a formação de biofilmes monoespécie. Esta diversidade conduz a uma multiplicidade de relações complexas envolvendo interações intraespécies e interespécies. Além disso, a formação de biofilmes no DWDS pode ser afetada por uma variedade de fatores bióticos e abióticos, nomeadamente: fatores ambientais (temperatura, pH), concentração residual de desinfetante, tipo e disponibilidade de nutrientes, condições hidrodinâmicas, conceção de rede, material de tubagem e acumulação de sedimentos. O controlo da formação do biofilme no DWDS é essencial para garantir que a água entregue ao consumidor é microbiologicamente segura. Neste trabalho, seis fungos diferentes foram primeiramente avaliados em termos de cinética de crescimento e formação de biofilme. Os seis fungos foram: P. expansum, P. brevicompactum, F. oxysporum, A. versicolor, Alternaria sp, e Mucor sp. Foi feito um stock de suspensão de esporos de cada fungo, e o ensaio do biofilme foi executado. Para a formação do biofilme, foram adicionados 200 µL de suspensão de esporos e caldo R2A em cada poço e foram utilizados métodos espectrofotométricos (método violeta cristal para quantificação da biomassa e método de resazurina para quantificação da atividade metabólica) para monitorizar a formação do biofilme ao longo do tempo. Foi também realizada a caracterização macroscópica e microscópica de cada fungo. No final, o fungo que apresentou maior formação de biomassa e atividade metabólica foi a Alternaria sp., e os valores foram de 20,070 ± 3,825 e 3695,625 ± 802,910, respetivamente. Este fungo foi escolhido para mais estudos a fim de compreender o seu comportamento sob diferentes condições de processo. As condições escolhidas foram a hidrodinâmica, a concentração de nutrientes, a presença de cloro, e uma associação interrelacionada. Em relação à hidrodinâmica, foram avaliadas quatro condições (estática, 30, 150, e 200 rpm). Após três dias de incubação, foram observadas algumas diferenças significativas entre as condições. A utilização de 200 rpm causou uma diferença significativa (ρ<0,05) em comparação com as condições estáticas e 30 rpm, o que significa que altas rotações podem influenciar o crescimento de fungos e a atividade metabólica. Nesta condição, houve um aumento da biomassa e da atividade metabólica, sugerindo que as altas rotações tiveram uma influência positiva. Em comparação com a concentração de nutrientes, foram avaliadas quatro condições diferentes (água da torneira sintética, ¼ R2B, ½ R2B, e meio R2B). Após três dias de incubação, observou-se que o STW causou diferenças significativas (ρ<0,05) em comparação com os outros, o que significa que o ambiente oligotrófico influencia negativamente o crescimento do fungo e a atividade metabólica. A exposição ao cloro foi estudada em 5 condições (sem cloro, 2,4 ppm, 6,03 ppm, 12,06 ppm, 24,12 ppm) e não revelou qualquer impacto significativo dos níveis de cloro na formação e atividade do biofilme, sugerindo a resistência dos fungos ao cloro. Para o fator interespécies foi utilizada uma estirpe de Stenotrophomonas maltophilia. Foram realizados três ensaios (Fungos e bactérias isolados e associados). Os resultados revelaram que a associação microbiana afetou a formação e atividade do biofilme, mostrando uma diminuição da biomassa e da atividade metabólica em comparação com o ensaio de fungos isoladamente. Finalmente, foi também executada a identificação das espécies de dois fungos utilizados neste trabalho. As Alternaria sp. e Mucor sp. foram os fungos que não foram previamente identificados até ao grupo de espécies. Para esta identificação, os fungos foram incubados em meio R2B, e o ADN foi extraído. Após a realização de alguns testes, tais como o NanoDrop, o gel de eletroforese da amostra e o ciclo de PCR, o ADN dos fungos foi sequenciado. Depois, foi criada uma árvore filogenética baseada nas sequências genéticas, com o mesmo marcador genético (ITS), de diferentes espécies de fungos relacionados com as amostras. Assim, a árvore filogenética do Mucor parece dirigir o Mucor sp. para o Mucor plumbeus e a árvore filogenética da Alternaria colocou a amostra na secção Alternata.