Development of thymus-based advanced therapies

Abstract

The thymus is a pivotal lymphoid organ that develops and selects T cells. The absence or pathologies of the thymus results in immunodeficiency, together with increased susceptibility to infections and autoimmune diseases. The gold standard approach to tackle these conditions is thymus transplantation. However, it relies on the use of allogenic tissue, impairing its easy applicability. Furthermore, this organ undergo involution throughout life and also as a result of acute chemical injuries. Nevertheless, it is possible to revert its involution by the administration of enhancers of the thymic function. Thymus tissue engineering has been proposed in response to these needs. Still, an effective solution to this important health problem was not achieved yet. One of the major problems of thymus tissue engineering is the source and functionality of thymic epithelial cells (TECs), which lose their functional signature when cultured in vitro. Different thymic bioengineered strategies for TEC culture and enhancement of the thymic function were herein studied. For that, two thymic extracellular matrix proteins (fibronectin and laminin-2) were immobilized at the surface of electrospun fibrous meshes (eFMs). Their effect on TEC cultures and thymocyte adhesion (in the case of laminin-2) were herein evaluated in vitro. The impact of feeder cell-derived ECM density on TEC cultures was also herein studied. Through these studies, it was demonstrated that the presence of ECM proteins and its density play important roles in the in vitro expansion of TECs. Aiming to mimic the thymus organization, novel silk scaffolds with a bilayered structure were developed and characterized. Using these substrates, it was confirmed that scaffolds microarchitecture and the co-culture of TECs play an important role in TEC functionality. Finally, the effect of intravenously injected conditioned media (CM) obtained from human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells (hAMMSCs) in the thymic function of aged mice was assessed. Experimental data demonstrated that hAMMSCs CM is a valuable resource to enhance the thymic function of aged mice, with a significant increase in T cell production. Ultimately, this thesis enabled the development of novel biomaterial-based substrates facilitating the development of in vitro TEC cultures. It also demonstrated the benefits of a new cell-free therapeutic option for thymic involution that has clinical translational potential.

O timo é um órgão linfoide essencial para o desenvolvimento e seleção dos linfócitos T. A ausência de timo ou as suas patologias resultam em imunodeficiência, aumentando a suscetibilidade a infeções e doenças autoimunes. A estratégia terapêutica mais comum é a transplantação tímica, embora se baseie no uso de tecido alogénico, dificultando a sua aplicabilidade. Por outro lado, este órgão involui naturalmente ao longo da vida ou como resultado de lesões químicas agudas. Não obstante, é possível atenuar esta involução mediante administração de potenciadores da função tímica. A engenharia de tecidos do tímo tem sido proposta como uma estratégia promissora. Uma das maiores dificuldades sentidas na engenharia de tecidos do timo é a dificuldade no estabelecimento de culturas de células epiteliais tímicas (TEC), mantendo a sua funcionalidade in vitro. Diferentes estratégias para a cultura de TEC e aumento da função tímica foram aqui estudadas. Especificamente, duas proteínas da matriz extracelular (MEC) do timo (fibronectina e laminina-2) foram imobilizadas à superfície de malhas fibrosas produzidas por “electrospinning”. O seu efeito sobre culturas de TEC e na adesão de timócitos (no caso da laminina-2) foram avaliadas in vitro. O impacto da densidade de MEC derivada de “feeder cells” foi também estudada. Estes estudos demonstraram que a presença de proteínas da MEC, assim como a sua densidade, desempenham um papel importante no sucesso do estabelecimento de culturas de TECs. Com o objetivo de mimetizar a organização tímica, novas estruturas bicompartimentalizadas feitas de seda foram desenvolvidas e caracterizadas. Confirmou-se que a microarquitectura porosa destas estruturas e a co-cultura de TEC têm um papel importante na sua funcionalidade. Por fim, foi avaliado o efeito da injecção sistémica de meio condicionado (CM) obtido da cultura de células humanas mesenquimais derivadas da membrana amniótica (hAMMSCs) na função tímica de ratinhos envelhecidos. Os dados experimentais demonstraram que o tratamento com CM é uma estratégia válida na recuperação da função tímica, mediante o aumento da produção de linfócitos T. Em resumo, nesta tese desenvolveram-se novos substratos à base de biomateriais que permitem a cultura de TECs in vitro. Foi também demonstrado que existem benefícios de uma nova estratégia terapêutica não-celular com CM para a involução tímica, com potencial translacional para a clínica.