Carboxylic acids transporters expression and regulation in yeast

Abstract

As espécies de Candida têm vindo a destacar-se como uma das causas mais comuns de infeções fúngicas, atingindo elevadas taxas de mortalidade. Em indivíduos saudáveis, estes microrganismos atuam como comensais inofensivos, colonizando diversos nichos do corpo humano. No entanto, quando o sistema imunológico está comprometido, estes assumem-se como patógeneos oportunistas. Ainda que Candida albicans continue a ser umas das principais causas de candidíase, outras espécies não-albicans são cada vez mais comuns. Recentemente, C. glabrata emergiu como a segunda causa mais comum de candidemia. Tal como as restantes espécies Candida, dada a sua flexibilidade metabólica, C. glabrata é capaz de se adaptar, colonizar e proliferar em diversos nichos do corpo humano, alguns deles deficientes em glucose. Assim, a sua capacidade de utilizar fontes de carbono alternativas é vital para a sua sobrevivência As proteínas Ato foram identificadas em S. cerevisiae como permeases de acetato, bem como de outros ácidos carboxílicos, como o lactato, para dentro da célula. Os genes homólogos correspondentes em C. glabrata (CgATO1, CgATO2 e CgATO3) parecem desempenhar um papel importante na sobrevivência e adaptação a determinados ambientes, onde os ácidos carboxílicos se apresentam como as principais fontes de carbono e energia. A aquagliceroporina Fps1 em S. cerevisiae também tem sido associada ao transporte de acetato. Os genes FPS1 e FPS2 codificam canais de glicerol em C. glabrata, com o FPS1 a desempenhar um papel importante na manutenção da osmorregulação. O objetivo desta tese foi caracterizar fenotipicamente um conjunto de mutantes de C. glabrata com a finalidade de entender o papel dos genes que codificam para os transportadores e canais ATO1, ATO1, ATO1, FPS1 e FPS2 na célula durante o crescimento em ácidos carboxílicos. A capacidade dos mutantes em alcalinizar o meio extracelular também foi testada. O nosso estudo validou a construção de todos os mutantes simples e múltiplos em transportadores ATO e FPS, utilizando a técnica de PCR de colónia. Este trabalho mostrou que em contraste com as restantes estirpes testadas o mutante quíntuplo apresenta uma capacidade reduzida de crescer na presença de acetato e lactato, como únicas fontes de carbono e energia, bem como de alcalinizar o meio extracelular. Assim, estes estudos sugerem um potencial mecanismo de regulação interdependente entre os transportadores Ato e Fps, que nunca havia sido identificado, até ao momento. No geral, os resultados obtidos no âmbito desta tese indicam que os transportadores Atos e Fps estão envolvidos no transporte de acetato e lactato, direta ou indiretamente Este trabalho de tese permitiu avançar o conhecimento sobre estes importantes transportadores de nutrientes à superfície da membrana plasmática, que poderão funcionar como potenciais alvos para o desenvolvimento futuro novos antifúngicos..

Candida species stand out as one of the most common causes of fungal infections, with one of the highest mortality rates. In healthy individuals, these microorganisms act as harmless commensals, colonizing several human body niches; however, when the immune system is compromised, they become opportunistic pathogens. While Candida albicans remains as one of the most common causes of candidiasis, other non-albicans Candida species are becoming more common. C. glabrata has recently emerged as the second most common cause of candidemia. Because of its high metabolic flexibility, C. glabrata, like other Candida species, can adapt to a wide range of environments, colonizing and proliferating in several human body niches, that can be deficient in glucose. That said, the ability to adapt to alternative carbon sources (acetate and lactate) is critical for its survival. Ato proteins were previously identified in S. cerevisiae as acetate permeases responsible for the uptake of acetate, as well as the transport of other carboxylic acids into the cell, such as lactate. C. glabrata corresponding homologue genes (CgATO1, CgATO2, and CgATO3) appear to play an important role in adaptation and survival to certain environments, where carboxylic acids represent the main carbon and energy sources. Furthermore, the aquaglyceroporin Fps1in S. cerevisiae has been linked to acetate transport. FPS1 and FPS2 encode putative glycerol channels in C. glabrata, with FPS1 playing an important role in osmotic homeostasis maintenance. The purpose of this thesis was to phenotypically characterize a set of C. glabrata deleted mutants on the putative transporters and channels encoding genes ATO1, ATO2, ATO3, FPS1 and FPS2, in order to understand the role of each transporter during carboxylic acid growth. The ability of the mutants to alkalinize the extracellular medium was also tested. Furthermore, by colony PCR the successful deletion of each transporter was confirmed, validating the construction of all single and multiple mutants on ATO and FPS transporters. This study found that the quintuple mutant had a growth defect when grown with only acetate and lactate as carbon and energy sources, as well as a reduced ability to alkalinize the extracellular medium. This is in contrast to what was discovered for the wild-type and mutant strains, where no growth defects were discovered. Thus, these studies suggest a potential interdependent regulatory mechanism between Ato and Fps transporters, which had never been identified until now. either directly or indirectly involved in the transport of acetate and lactate. This thesis work allowed us to advance our understanding of these important nutrient transporters at the plasma membrane's surface, which could serve as potential targets for the development of new antifungals in the future.