Interplay between adipose-derived stem cells and inflammatory mediators: impact on neurite outgrowth and vascular morphogenesis

Abstract

A lesão da medula espinal (SCI) é uma condição que impede a comunicação entre o cérebro e o resto do corpo, resultando em comorbidades que diminuem a qualidade de vida dos pacientes. Após a lesão primária, vários processos bioquímicos danificam a medula espinal resultando numa variedade de eventos patológicos que dificultam a recuperação. Para além da perda neural, também ocorre um dano vascular extenso. Na procura de novas terapias, as células estaminais derivadas do tecido adiposo (ASCs) têm mostrado resultados promissores por modularem vários processos regenerativos, a nível parácrino e não-parácrino. Contudo, as ASCs ainda não desenvolveram uma reparação satisfatória. Para aumentar o potencial regenerativo destas células, vários investigadores estão a tentar precondicioná-las com diferentes estímulos, tais como moléculas inflamatórias. Enquanto está descrito que estímulos pró-inflamatórios levam a um fenótipo mais imunomodulatório das ASCs, pouco se sabe sobre os efeitos desta estimulação a um nível neural e vascular. Assim, neste trabalho, pretendeu-se perceber como é que moléculas pró e anti-inflamatórias podiam influenciar o potencial angiogénico e neuroregenerativo das ASCs em três níveis: contacto indireto, direto e secretoma. Para isso, desenvolveu-se um sistema que avalia parâmetros morfológicos de estruturas semelhantes a vasos produzidas por células endoteliais da veia umbilical humanas (HUVECs). Com este sistema, a estimulação pró-inflamatória com lipopolisacarideo (LPS) e interferão- γ (IFN- γ) aumentou o potencial vascular do secretoma das ASCs. Porém, este efeito não se observou na co cultura indireta. No ensaio de contacto direto não houve formação destas estruturas. A estimulação com IL-10 não alterou o comportamento das ASCs. Explantes de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram usados para avaliar o potencial neuroregenerativo das ASCs. Não foram observadas diferenças entre os grupos estimulados e não estimulados relativamente à área de neurites, ao seu tamanho e padrão de arborização. Contudo, o secretoma de ASCs conseguiu induzir o crescimento de neurites em contraste com o grupo controlo. Observaram-se resultados semelhantes para o ensaio de contacto direto, que estimulou o maior grau de crescimento. O ensaio de contacto indireto também levou a um crescimento robusto de neurites. Para saber quais moléculas podiam ser moduladas por estes fatores, realizou-se uma análise de expressão genética de vários fatores relacionados com os processos estudados. Apesar de alguns genes serem diferentemente expressos, não se observou um fenótipo claro. Em suma, este projeto mostrou que as ASCs podem ser moduladas por moléculas inflamatórias, mas o estímulo apropriado para fazer um melhoramento máximo destas células ainda precisa de ser clarificado.

Spinal cord injury (SCI) is a condition that hampers the communication between the brain and the rest of the body, resulting in several comorbidities that decrease the patient’s life quality. After the primary injury, several biochemical processes occur that damage the spinal cord resulting in a variety of interconnected pathological events that hinder the chance of recovery. Besides the neural loss, SCI also leads to a strong vascular damage. In the search for new therapies, adipose-derived stem cells (ASCs) have shown promising results due to their ability to modulate several processes related to repair, both at a paracrine and non-paracrine level. However, up until today, ASCs were unable to elicit a completely satisfactory repair. Thus, to promote a regenerative enhancement of ASCs, several researchers are trying to precondition these cells with different stimuli, for example, with inflammatory mediators. While it is well reported that pro-inflammatory stimuli alter ASCs to a more immunomodulatory profile, few reports show the effects of this stimulation at a neural and vascular level. Therefore, in this work, we aimed to understand how classical pro-inflammatory and anti-inflammatory molecules could influence the angiogenic and neuroregenerative potential of ASCs on three different levels: indirect contact, secretome and direct contact. To do that, a system that evaluated morphological parameters of vessel-like structures created by human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) was established. With this system, pro-inflammatory stimulation with lipopolysaccharide (LPS) and interferon-γ (IFN-γ) enhanced the vascular potential of ASCs secretome. However, this effect was lost in the indirect co-culture. No vessel-like structures were formed in direct contact assay. Stimulation with IL-10 did not alter ASCs behavior. Dorsal root ganglia explants were used to evaluate the neuroregenerative potential of ASCs. No differences between stimulated and unstimulated groups were found regarding neurite area, length and arborization pattern. However, the secretome of ASCs could induce neurite growth in contrast to the control. In the direct cell contact assay, the results were similar. Moreover, direct contact stimulated the highest neurite outgrowth. Nonetheless, indirect contact also elicited a robust formation of neurites. In order to understand which molecular players were being modulated by these factors, gene expression analysis was done to several molecules related to vascularization and axonal growth. Although it was possible to discover some altered expressed genes, no clear phenotype was observed. Overall, this project showed that ASCs are able to be modulated by inflammatory molecules but the appropriate stimuli to fully enhance these cells still needs to be further clarified.