Novel phenotypic features of the malaria parasite through time-domain nuclear magnetic resonance

Abstract

As infeções de malária continuam a ser um flagelo em regiões endémicas de todo o mundo, atrasando o crescimento económico e reduzindo a esperança de vida das crianças. O caminho para o controlo e eliminação da malária tem sido dificultado pela resistência aos medicamentos e ferramentas de diagnóstico ineficazes para detetar infeções de baixa densidade e assintomáticas. Com a carteira limitada de medicamentos disponíveis para tratar a malária, é fundamental melhorar a compreensão dos mecanismos de resistência e avaliar a biologia e patogénese das células parasitárias. Nesta dissertação, visamos explorar a tecnologia espectroscópica de Ressonância Magnética Nuclear de baixo campo (RMN), juntamente com abordagens genéticas inversas para estudar a haemozoin, um biomarcador natural de parasitas da malária com propriedades magnéticas únicas e cuja via biológica para a sua formação, está de alguma forma relacionada com a maioria dos medicamentos antimaláricos conhecidos. Caracterizámos o parasita em diferentes fases morfológicas utilizando a RMN de baixo campo para definir as interações paramagnéticas e a dinâmica de troca de estirpes resistentes a parasitas. A partir destas medições, caracterizámos com sucesso todo o ciclo intra eritrócito do parasita Plasmodium falciparum, ligando alguns padrões de RMN de domínio temporal a alterações fisiológicas específicas, tais como os parasitas específicos de ponto temporal que se deslocam para uma nova fase de desenvolvimento. Para explorar a capacidade de detetar características distintas de RMN relacionadados com perturbações na via de desintoxicação da hemoglobina, concentrámo-nos no estudo do PfMDR2, um transportador de metais pesados e nas plasmepsinas, protéases aspárticas que degradam a hemoglobina dentro do vacúolo alimentar do parasita. Concebemos uma estratégia para o KO pfmdr2 na estirpe P. falciparum Dd2 e realizámos um ensaio de fracionamento da hemoglobina em parasitas geneticamente modificados, sobre expressores de plasmepsinas. Os dados de RMN de baixo campo obtidas a partir deste estudo foram capazes de distinguir as fases de parasitas e parasitemia tão baixo quanto 0,01% e revelaram um elevado potencial para explorar ainda mais o equilíbrio magnético entre espécies de hemorragia e a sua possível correlação com a suscetibilidade dos parasitas aos fármacos. São necessários estudos futuros para explorar melhor o papel deste transportador e das enzimas no equilíbrio das espécies de hemorragia e a sua capacidade de fornecer impressões digitais fenotípicas distintas de NMR. Dadas as características de portabilidade de um dispositivo de RMN de baixo campo, a captura de dados específicos de RMN poderia fornecer um protótipo para a potencial distribuição de medicamentos com precisão contra a malária no futuro, aos pacientes.

Malaria infections remain a scourge in endemic regions worldwide, stalling economic growth and reducing life expectancyin children. The path towards malaria control and elimination has been hindered by drug resistance and ineffective diagnostic tools to detect low density and asymptomatic infections. With the limited portfolio of drugs available to treat malaria, it is fundamental to improve the understanding of resistance mechanisms and appraise parasite cell biology and pathogenesis. In this dissertation, we aimed to exploit low-field Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopic technology, along with reverse genetics approaches to study hemozoin, a natural malaria parasite biomarker with unique magnetic properties and which biological pathway to its formation, is somehow related with most of the known antimalarial drugs. We have characterized the parasite at different morphological stages using low-field NMR in order to define the paramagnetic interactions and the exchange dynamics of parasite-resistant strains. From these measurements, we successfully characterized the entire intraerythrocytic cycle of the Plasmodium falciparum parasite linking some behavioral time-domain NMR patterns to specific physiological changes such as the specific time-point parasites move to a new stage development. To explore the capability of detecting distinct NMR features related with disturbance in haem detoxification pathway, we focused on the study of PfMDR2, a heavy metal transporter and on plasmepsins, aspartic proteases that degrade haemoglobin inside the parasite food vacuole. We designed a strategy to KO pfmdr2 into P. falciparum Dd2 strain and performed a haem fractionation assay on previously genetic engineered parasites over-expressing plasmepsins. The low-field NMR fingerprints obtained from this study was capable to distinguish parasite stage and parasitaemia as low as 0.01% and revealed high potential to further exploit the magnetic balance between haem species and its possible correlation with parasite susceptibility to drugs. Future studies are needed to explore better the role of this transporter and enzymes in the balance of the haem species and their ability to deliver distinct phenotypic NMR fingerprints. Given the portability characteristics of a low-field NMR device, the capture of specific NMR fingerprint could provide a proof-of-concept towards potential delivery of future precision malaria medicine, at the patients side.