DNA metabarcoding monitoring of zooplankton for the detection of non-indigenous species (NIS): a seasonal study in a recreational marina of the northwest of Portugal

Abstract

O DNA metabarcoding é uma ferramenta poderosa para avaliar a biodiversidade. Tem o potencial de ser mais eficaz na monitorização das comunidades zooplanctónicas e na deteção de potenciais NIS, mas extremamente dependente das várias metodologias adotadas ao longo da sua cadeia analítica. Como tal, os objetivos desta tese foram: i) fazer um estado da arte das metodologias que têm sido adotadas para monitorizar as comunidades de zooplâncton usando DNA metabarcoding (desde a amostragem à sequenciação), com base na literatura; ii) avaliar a capacidade de dois marcadores genéticos, o gene que codifica para subunidade I da enzima citocromo C oxidase mitocondrial (COI) e a região variável V4 do gene que codifica para pequena subunidade do gene ribossomal nuclear (18S), na monitorização da dinâmica sazonal das comunidades de zooplâncton, incluindo NIS, através de DNA metabarcoding, na marina recreacional de Viana do Castelo, localizada no estuário do rio Lima (NO Portugal) e iii) comparar posteriormente a diversidade obtida com uma lista compilada de espécies de zooplâncton com ocorrência confirmada no estuário do rio Lima, e que foram previamente identificadas com base na morfologia. Para tal, as comunidades de zooplâncton foram amostradas ao longo de 3 estações consecutivas (primavera, outono e inverno 2020/2021), em 3 pontos amostragem na marina recreacional. A área de estudo foi dominada pelo meroplâncton, uma vez que o DNA metabarcoding detetou 155 espécies diferentes, das quais os Annelida, Arthropoda e Mollusca contabilizaram cerca de 68%. Aproximadamente 12% das espécies detetadas foram previamente reportadas no estuário em comunidades de zooplâncton e macrozoobentos, incluindo uma NIS. Cinco novas potenciais NIS foram também detetadas. A maioria das espécies foram recuperadas através do marcador 18S. Esta ferramenta providenciou ainda informação mais pormenorizada acerca dos padrões sazonais da diversidade zooplanctónica no estuário do rio Lima, algo que ainda se encontrava por revelar. A maioria das espécies, incluindo as NIS, foram detetadas na primavera-outono. Assim sendo, este estudo vem destacar ainda mais a eficácia desta ferramenta em avaliar as dinâmicas do zooplâncton, e ainda o seu uso na monitorização de comunidades naturais de zooplâncton, particularmente no caso em que as NIS são o alvo principal. A padronização dos protocolos do DNA metabarcoding é um passo chave, rumo ao desenvolvimento de programas de monitorização de invertebrados não indígenas utilizando o zooplâncton, o que envolve algumas melhorias técnicas, como por exemplo, o uso de múltiplos pares de primers para a mesma região genética, o desenvolvimento de bibliotecas de sequências de referência locais e uma base de dados regional ou local de NIS, e a aplicação de uma amostragem mais extensiva (ao nível espacial e temporal). Finalmente, a comparação das espécies recuperadas por DNA metabarcoding com listas compiladas de espécies ocorrentes no local de estudo, é essencial de forma a avaliar a eficácia desta ferramenta, embora algumas discrepâncias possam ser encontradas.

DNA metabarcoding is a powerful technique for assessing biodiversity that has the potential to be a more effective and reliable tool for monitoring zooplankton communities and detecting new putative NIS. However, the efficacy of this tool is highly dependent on the methodologies adopted along its analytical chain. As a result, the current thesis aims were i) make a state-of-the-art of the methodologies that have been used in several studies found in the literature, using DNA metabarcoding to monitor zooplankton communities (from sampling to sequencing); ii) to examine the capacity of two genetic markers, the mitochondrial cytochrome C oxidase subunit I gene (COI) and the variable region V4 of the nuclear ribosomal small subunit gene (18S), to assess the seasonal dynamics of zooplankton communities, including NIS, through DNA metabarcoding, in the recreational marina of Viana do Castelo, located in the Lima River estuary (NW Portugal), and iii) to further compare the recovered diversity with a compiled list of zooplanktonic species with reported occurrence in the Lima River estuary, using morphology-based assessments. To this end, zooplankton communities, spanning three consecutive seasons (spring, autumn, and winter 2020/2021), were sampled in three sampling points in the recreational marina. The studied area was dominated by meroplankton, since metabarcoding, in general, recovered 155 distinct species, with Annelida, Arthropoda and Mollusca accounting for around 68%. Approximately 12% of the zooplanktonic and macrozoobenthos species recovered, were reported previously to occur in the estuary, including one NIS. Five additional potential NIS were detected. Majority of species were detected with 18S. Metabarcoding provided further insights into seasonal patterns within Lima River estuary zooplankton biodiversity, not yet uncovered. Most of the species (including NIS) were found during spring-autumn period. This study further highlights the effectiveness of this tool in assessing the dynamics of zooplankton, and in using it for monitoring naturally occurring zooplankton, particularly if newly introduced NIS are the main target. Standardization of DNA metabarcoding protocols is a critical step towards the development of invertebrate NIS monitoring programs targeting zooplankton communities, therefore, further improvements are critical, such as, employment of multiple primers pairs targeting the same genetic regions, the generation of local reference sequences libraries and a regional or local NIS database, allied with an extensive spatial and temporal sampling. Finally, the comparison of DNA metabarcoding recovered diversity with compiled lists of previously reported occurring species is crucial to evaluate the efficiency of this tool, although some discrepancies are expected to occur.