Quantitative image analysis as a diagnostic tool for identifying structural changes of anaerobic granular sludge

Abstract

In this thesis quantitative image analysis techniques were applied to monitor structural changes of anaerobic sludge under different operating conditions. In a first experiment that lasted 177 days, the phenomenon of aggregation of dispersed sludge was quantitatively monitored through the recognition and quantification of aggregates and free filaments. Free filaments were defined as filaments completely buoyant in the medium possessing both extremities free and those with only one free extremity being the other attached to an aggregate. A parameter defined as the ratio between the total free filament length and the total aggregate area (LfA) proved to be sensitive to structural changes in the aggregation status of the anaerobic sludge. LfA allowed the recognition of the aggregation time and revealed to be a good indicator of granular sludge fragmentation and erosion which usually leads to washout in high rate reactors. In a second operation period, image analysis was applied to monitor morphological changes in the previously formed granules, induced by increases in the upflow velocity and in the organic loading rate. In a further work, the initial stages of granules formation in EGSB reactors was assessed, with glucose and also gelatine as primary substrates. Granule development was monitored by image analysis techniques and FISH combined with confocal laser scanning microscopy. Strength, density and settling velocity were the bulk properties analyzed. Supported by the results, it is proposed that instead of nucleating and growing as a dense conglomerate, anaerobic granules initially grow in a sparse conglomerate to a large size, and then increase in density to maturity. In a later work, four EGSB reactors were operated at different influent nitrate concentrations (0, 20, 60 and 100 mgN-NO3-/L). After about 20 days of operation, the granular sludge was characterized morphologically by quantitative image analysis. Also specific methanogenic activities and settling velocities were measured. LfA parameter, was sensitive to quantify the different surface morphology, induced by nitrate in the anaerobic granular sludge. In a final experiment and in order to study the recovery of the SAA in granular sludge, an EGSB reactor was operated with ethanol was fed as the sole carbon source, during a trial period of 106 days. Quantitative image analysis allowed for information to be obtained on granular fragmentation/erosion and filaments release. Granular fragmentation and increase of filaments in the bulk simultaneous with the increase in the acetoclastic activity are described for the first time and might represent a structural response of granular sludge to promote the optimal substrate uptake at minimal diffusion limitations.

Nesta tese são aplicadas técnicas de análise quantitativa de imagem para monitorizar alterações estruturais de biomassa anaeróbia em diferentes condições operatórias. Numa primeira experiência de 177 dias monitorizou-se o fenómeno de agregação de biomassa anaeróbia dispersa, através do reconhecimento e quantificação de agregados e filamentos livres. Filamentos livres foram definidos como filamentos que estão completamente livres no meio e que portanto possuem as duas extremidades livres, e também os filamentos que têm apenas uma extremidade livre e a outra ligada a um agregado. Definiu-se uma parâmetro que representa a razão entre o comprimento total de filamentos livres e a área total dos agregados (LfA). LfA provou ser sensível a alterações do estado de agregação da biomassa, e permitiu identificar o tempo de granulação. Mostrou ainda ser um bom indicador de fenómenos de erosão e fragmentação granulares que estão normalmente associados ao “washout” em reactores de alta carga. Numa segunda experiência, as técnicas de análise de imagem descritas foram aplicadas na monitorização dos grânulos previamente formados e nas alterações estruturais induzidas por variações na velocidade superficial e na carga orgânica aplicada. Numa outra experiência foram monitorados os estágios iniciais da formação de grânulos, usando glucose e gelatina como substratos. O desenvolvimento dos grânulos foi monitorizado por técnicas de análise de imagem e por técnicas de hibridização “in-situ” de fluorescência, combinadas com microscopia confocal laser. Foram medidas características físicas dos grânulos tais como resistência mecânica, densidade e velocidade de sedimentação. Com base nos resultados obtidos é proposto um novo modelo de granulação, segundo o qual, em vez de haver uma nucleação inicial e o crescimento de um agregado denso, se formam inicialmente agregados pouco densos que crescem até um tamanho razoável e que então se tornam mais densos, numa fase de maturação. Numa outra experiência foi utilizada a técnica de análise de imagem para avaliar as alterações morfológicas induzidas pela presença de nitrato em quatro reactores EGSB, alimentados com 0, 20, 60 e 100 mgN-NO3-/L, respectivamente. Após 20 dias de operação a biomassa granular foi caracterizada em termos de actividade metanogénica, morfologia e velocidade d sedimentação. O parâmetro LfA foi sensível às alterações morfológicas dos agregados microbianos, induzidas pelo nitrato. Numa experiência final foi estudada a recuperação da actividade metanogénica acetoclastica em biomassa anaeróbia granular durante 106 dias, num reactor EGSB alimentado com etanol. Através da análise quantitativa de imagem foi possível quantificar fenómenos de fragmentação erosão e libertação de filamentos durante o processo e relacioná-los com o aumento de actividade metanogénica acetoclastica observada durante o período experimental. Sugeriu-se que as alterações estruturais dos grânulos observadas, nomeadamente a libertação de filamentos e a fragmentação poderão ser um mecanismo de resposta dos agregados no sentido de promover a máxima assimilação de substrato minimizando problemas de limitações difusionais.