New 3D scaffolds and adequate mesenchymal stem cells culture methodologies for engineering an articular cartilage transplant

Abstract

Cartilage is a type of dense connective tissue that possesses interesting features in terms of organization and functionality. It has only one type of cells – the chondrocytes – which are embedded in an extensive network constituted mostly of collagens and proteoglycans. It is also avascular, exhibiting a low metabolic rate and a subsequent low regenerative potential. Articular cartilage is a particular type of hyaline cartilage that has an important structural function in the skeletal system as a weight bearing tissue, creating smooth gliding areas that can absorb both shocks and loads in an efficient way. Due to its nature, articular cartilage function may be severely affected by trauma events, aging related degeneration such as osteoarthritis, or developmental disorders, since no efficient regeneration of the damaged tissue is performed. A direct result of this is chronic pain and disability conditions that seriously limit normal everyday life. Different possible solutions have been experimented to solve these conditions, such as prosthetic joint replacement, arthroplasty, and drilling, but the outcomes are still not satisfactory which imposed the need for alternative approaches. Tissue engineering has been proposed as a new method to address these problems, being widely studied as a promising therapeutic tool. The tissue engineering strategy usually implies the use of a 3D structure that is able to support cells growth and differentiation in an adequate environment towards the development of a functional tissue engineered system. The support systems fabricated for these purposes can be of natural or synthetic origin, or either a combination of both. Different materials have been produced and processed in various ways with the aim of conferring specific properties that are expected to render the best performances. The main goal of the work described in this thesis was to develop a system that can be easily, efficiently, and successfully applied in the treatment of articular cartilage lesions. Due to its potential, the concept of tissue engineering was applied by using natural origin based structures combined with different cell types (cell lines, primary culture differentiated and undifferentiated cells) in adequate culturing environments. Among the several support structures studied, the emphasis of the work was put on the development and application of a minimally invasive injectable hydrogel system which testing started from its ability to be used as a cell supporting material to in vivo functional studies in an articular cartilage rabbit knee defect model. In the initial part of the work presented in this thesis, the first tested structures consisted of scaffolds of chitosan and polybutylene succinate processed by compression moulding with salt leaching that were used to support the growth and chondrogenic differentiation of BMC9 cells – a mouse bone marrow derived mesenchymal progenitor cell line. The cells were able to proliferate and colonize the scaffolds structure, remaining viable during the time of the experiments. Immunological analyses further indicated that the BMC9 cells were being differentiated towards the chondrogenic pathway. A different structure of the scaffolds was experimented using the same blend of chitosan and polybutylene succinate by processing it in the form of fibres and producing a 3D fibre scaffold that was at this time used to culture primary culture chondrocytes from bovine origin. The chondrocytes exhibited a normal and typical morphology, colonising both the surface and inner pores of the scaffolds. Cartilage-like extracellular matrix formation was observed by the deposition of collagen type II and proteoglycans, indicating that chitosan and polybutylene succinate fibre based scaffolds had good potential as matrices for the regeneration of cartilage. A different natural fibre based scaffold consisting of a blend of starch and polycaprolactone was also investigated regarding its ability to support growth and extracellular matrix formation by bovine articular chondrocytes seeded in vitro. The chondrocytes presented normal morphological features with extensive cells presence at the surface of the support structures, and penetrating the scaffolds pores. Qualitative and quantitative analyses showed that typical cartilage extracellular matrix components were being deposited during the course of the experiments thereby showing the potential of these systems for future applications in the field. Another type of support, and the more extensively studied within the work described in this thesis, was a natural origin hydrogel – gellan gum - that was firstly tested to be used as a cell encapsulating agent. Gellan gum was shown to be versatile in terms of applications with the possibility of being used as a cell/drug delivery vehicle in different situations. In terms of cartilage regenerative approaches, its material properties and non cytotoxic nature were shown suitable for the proposed application. A final stage of this part involved the encapsulation and in vitro culturing of human nasal chondrocytes in gellan gum hydrogels which remained viable showing the potential of these new systems as cell supports for cartilage regeneration. In the following work, gellan gum hydrogels were tested for their ability to be used as injectable systems for delivering and maintaining human chondrocytes by in situ gelation, as well as for supporting cell viability and production of extracellular matrix. The characterization of some of the materials properties showed their injectability under physiological conditions and with the encapsulation and culturing of human articular chondrocytes it was possible to observe that cells were viable and actively depositing cartilage-like extracellular matrix. In a final stage, the in vivo performance of the gellan gum hydrogels, in terms of induced inflammatory reaction and integration into the host tissue, was performed upon subcutaneous implantation in mice. The results showed a residual response from the organisms and maintenance of the mechanical stability of the gels throughout the implantation periods. These results prompted the study of the gellan gum with human chondrocytes systems in vivo to test for cartilage-like tissue formation. Gellan gum hydrogels were combined with human articular chondrocytes and were subcutaneously implanted in the back of nude mice. The results showed a homogeneous cell distribution and the typical round shape morphology of the chondrocytes within the matrix upon implantation. Proteoglycans synthesis was detected in the histological sections and a statistically significant increase of proteoglycans content in gellan gum-human articular chondrocytes tissue engineered constructs was measured with the GAG assay from 1 to 4 weeks of implantation. Real-time PCR analyses showed a statistically significant upregulation of collagen type II and aggrecan levels in the same periods, while the immunological assays suggested deposition of collagen type II along with some collagen type I. The overall data reinforced the previously observed potential of gellan gum hydrogels in the generation of a fully functional cartilage tissue engineered construct. Finally, the last study performed under the scope of this thesis looked into the therapeutic effect of gellan gum hydrogels when combined with adipose tissue derived progenitor cells and injected in rabbit full-thickness articular cartilage defects in an autologous approach. Adipose tissue derived progenitor cells (chondrogenic pre-differentiated and non pre-differentiated) where compared with articular chondrocytes, gellan gum alone, and empty defects. The cell loaded hydrogels showed the best macroscopic appearance and integration with the native tissue. Histological scoring and staining, along with real-time semiquantitative PCR analyses, provided results that taken together showed that gellan gum hydrogels in combination with adipose tissue derived progenitor cells constitute a promising approach for the treatment of articular cartilage defects, being a possible candidate for future clinical applications in this field. As a concluding remark, it can be stated that the work performed in this thesis tested several supports for application in the cartilage tissue engineering field, with the main emphasis being put in gellan gum hydrogels. Gellan gum was originally suggested and tested as a new support to aid in cartilage tissue regeneration. Gellan gum was shown to be a promising biomaterial for these purposes as evidenced by its materials properties, in vitro, and in vivo results. Such evidences suggest that the herein described gellan gum systems combined with different cells types, namely adipose tissue derived progenitor cells, may have potential clinical application in the treatment of cartilage defects.

A cartilagem é um tipo de tecido conectivo denso que possui características interessantes em termos da sua organização e funcionalidade. Tem apenas um tipo de células - os condrócitos - que estão incluídos numa matriz extracelular constituída maioritariamente de colagéneo e proteoglicanos. É igualmente avascular, exibindo uma baixa taxa metabólica e um baixo potencial regenerativo. A cartilagem articular é um tipo particular de cartilagem hialina que tem uma função estrutural importante no sistema esquelético já que pode ser vista como um sistema de suporte de cargas capaz de criar áreas de deslizamento suaves que podem absorver choques e cargas de uma forma eficaz. Devido a sua natureza, a função articular da cartilagem pode ser severamente afectada por eventos traumáticos, desgaste progressivo do tecido e mecanismos degenerativos tal como a osteoartrite, dado que uma regeneração eficiente do tecido danificado não acontece na maior parte dos casos. Uma consequência directa destes acontecimentos são condições crónicas de dor e incapacidade que limitam seriamente a vida quotidiana normal. Foram testadas diferentes soluções para resolver estes problemas, tais como a utilização de próteses, artroplastia, entre outros procedimentos cirúrgicos, mas a falta de resultados satisfatórios impõe a necessidade de aproximações alternativas. A engenharia de tecidos é um método inovador proposto para tratar estas situações, estando a ser extensamente estudado como uma ferramenta terapêutica promissora. A estratégia de engenharia de tecidos implica geralmente o uso de uma estrutura 3D que possa suportar o crescimento e diferenciação de células num ambiente adequado para o desenvolvimento de um tecido funcional. As estruturas de suporte fabricadas para este fim podem ser de origem natural ou sintética, ou alternativamente uma combinação de ambos. Têm sido produzidos e processados materiais com diferentes características tendo em vista a obtenção de propriedades específicas que permitam obter melhores desempenhos. O objectivo principal do trabalho descrito nesta tese foi o desenvolvimento de um sistema que pudesse para ser aplicado facilmente, eficientemente, e com sucesso no tratamento de lesões articulares da cartilagem. Tendo em conta o seu potencial, o conceito de engenharia de tecidos foi aplicado usando estruturas de origem natural combinadas com tipos diferentes de células (linhas celulares, culturas primárias de células diferenciadas e não diferenciadas) em ambientes de cultura adequados. Entre as diversas estruturas de suporte estudadas, o enfoque do trabalho recaiu fundamentalmente sobre o desenvolvimento e a aplicação de um sistema injectável de invasão reduzida. Os testes com o material, a goma gelana, e o sistema em si, foram iniciados com a avaliação das capacidades deste para ser utilizado nestas aplicações e desenrolaram-se até à realização de estudos funcionais in vivo num modelo animal (coelho) onde foram criados defeitos na cartilagem articular e avaliado o potencial regenerativo dos sistemas. articular do defeito do joelho do coelho da cartilagem. Na parte inicial do trabalho apresentado nesta tese, os primeiros estudos foram realizados com estruturas de suporte 3D à base de polibutileno sucinato e quitosano processado através de moldação por compressão com lixiviação de sal. Estes suportes foram usados para suportar o crescimento e a diferenciação condrogénica de células BMC9 – uma linha celular mesenquimal progenitora obtida a partir de medula de rato. As células proliferaram e colonizaram as estruturas de suporte, permanecendo viáveis durante a o tempo das experiências. Análises morfológicas e imunológicas indicaram que as células BMC9 estavam a seguir a via de diferenciação condrogénica. Uma outra estrutura de suporte foi criada usando a mesma mistura à base de polibutileno sucinato e quitosano mas processada desta vez sob a forma de fibras por microextrusão e formando o suporte 3D através de pontos de ligação entre as fibras. A estrutura foi utilizada como suporte ao cultivo de condrócitos articulares bovinos de cultura primária. Os condrócitos exibiram uma morfologia normal e típica, colonisando os poros de superfície e internos das estruturas de suporte. A formação de matriz extracellular cartilagínea foi observada pela deposição de colagénio tipo II e proteoglicanos, indicando que estes suportes à base de polibutileno sucinato e quitosano têm potencial para a regeneração de cartilagem. Um suporte natural diferente, também à base de fibras, constituiu o objecto de estudo seguinte. Este foi fabricado a partir da mistura de amido de milho e policaprolactona e foi investigado igualmente acerca da sua capacidade para suportar o crescimento e a formação de matriz extracellular cartilagínea por condrócitos articulares bovinos de cultura primária. Os ccondrócitos apresentaram características morfológicas normais com presença extensiva de células na superfície e aréas internas das estruturas da sustentação. As análises qualitativas e quantitativas mostraram existir deposição de componentes típicos da matriz extracellular da cartilagem, evidenciando desse modo o potencial destes sistemas para aplicações futuras nesta área Um outro tipo de suporte, e o mais extensivamente estudado no âmbito do trabalho descrito nesta tese, foi um hidrogel de origem natural - a goma gelana. A capacidade da goma gelana ser utilizada com agente de encapsulamento de células foi inicialmente testada. Foi demonstrado que a goma gelana é versátil em termos de aplicações e pode ser utlizada como um veículo de entrega de células/fármacos em diferentes cenários. Em termos de regeneração de cartilagem, as suas propriedades materiais e natureza não citotóxica revelaram-se apropriadas para as aplicações propostas. A parte final deste primero estudo envolveu o encapsulamento e cultivo in vitro de condrócitos nasais humanos nos hidrogéis de goma gelana. Estes permaneceram viáveis confirmando novamente o potencial destes novos sistemas no suporte de células tendo como objectivo a regenração de cartilagem. No trabalho seguinte, os hidrogéis de goma gelana foram optimisados para poderem ser utilizados como sistemas injectáveis capazes de entregar e manter condrócitos humanos no local do defeito através da gelificação in situ. Subsequentemente, estes deveriam manter a viabilidade das células encapsuladas e sustentaram a produção de matriz extracelular. A caracterização de algumas das propriedades destes materiais demonstrou o seu carácter injectável em condições fisiológicas, assim como foi possível constatar que as células encapsuladas e cultivadas se mantiveram viáveis sintetisando activamente matriz extracelular cartilagínea. Na parte final, o desempenho dos hidrogéis de goma gelana in vivo , no que se refere à reacção inflamatória e integração pelo tecido do anfitrião, foi testado através de implantação subcutânea em ratinhos. Os resultados mostraram uma resposta residual dos organismos e uma manutenção da estabilidade mecânica dos geis ao longo dos períodos de implantação. A obtenção destes resultados suscitou o interesse de estudar a formação de tecido cartilagíneo pela goma gelana quando utilizada com condrócitos humanos in vivo . Os hidrogeis foram então combinados com os condrócitos articulares humanos e implantados subcutaneamente no dorso de ratinhos atímicos. Os resultados mostraram uma distribuição homogénea das células que apresentaram a morfologia típica dos condrócitos. A síntese de proteogicanos foi detectada nas secções histológicas e um aumento estatisiticamente significativo das quantidades de proteoglicanos foi medido com o teste de quantificação de glicosaminoglicanos durante a primeira e quarta semanas de implantação. As análises de PCR em tempo real revelaram um aumento estatisiticamente significativo do colagénio tipo II e dos níveis de agrecano nos mesmos períodos, enquanto que os ensaios imunológicos sugeriram o depósito de colagénio tipo II, assim como algum colagénio tipo I. Estes dados reforçaram o potencial previamente observado dos hidrogeis de goma gelana na geração de um tecido cartilagíneo funcional. Finalmente, o último estudo experimental realizado no âmbito desta tese teve como objectivo avaliar o efeito terapêutico dos hidrogeis de goma gelana combinados com células progenitoras do tecido adiposo quando injectados em defeitos totais da cartilagem articular de coelhos, num modelo de aproximação autólogo. Células progenitoras do tecido adiposo (sujeitas a prédiferenciação condrogénica e não pré-differenciadas) foram comparadas com condrócitos articulares, a goma gelana apenas, e com os defeitos vazios. Os hidrogeis conjugados com células apresentaram os melhores resultados em termos macroscópicos e de integração com o tecido nativo. Os resultados da avaliação histológica quantitativa e qualitativa, assim como as análises semiquantitativas de PCR em tempo real, demonstraram que a combinação de goma gelana células progenitoras do tecido adiposo constituem uma aproximação promissora no tratamento de defeitos da cartilagem articular, sendo estes sistemas fortes candidatos para aplicações clínicas futuras neste campo. De um ponto de vista geral, pode referir-se que o trabalho executado nesta tese testou diversos suportes com potencial aplicação no campo da engenharia de tecidos de cartilagem, tendo sido a ênfase principal colocada nos hidrogeis de goma gelana. Foi aqui demonstrado que a goma gelana é um material promissor para este tipo de aplicações, como se constatou pelas suas propriedades materiais, assim como resultados de ensaios in vitro e in vivo . Tais evidências sugerem que os sistemas de goma gelana aqui descritos combinados com diferentes tipos de células, nomeadamente células progenitoras do tecido adiposo, poderão ter uma potencial aplicação clínica no tratamento de defeitos da cartilagem.