Arabinogalactan proteins: deciphering their function while looking at the sugars

Abstract

As sementes encontram-se na base da nutrição humana e são formadas através da combinação de dois gámetas masculinos e dois gâmetas femininos (dupla fecundação). Devido ao crescente aumento da população, é essencial aumentar a produção agrícola. Consequentemente, compreender os mecanismos que garantem o sucesso reprodutivo é fundamental. As proteínas arabinogalactãnicas (AGPs) são proteínas altamente glicosiladas essenciais para o processo reprodutivo das plantas. As AGPs são decoradas por 90% de polissacarideos arabinogalactânicos, compostos de arabinose e galactose, e outros açúcares, como ácido glucurônico (GIcA), fucose e ramnose. Uma vez que os açúcares revestem a superfície molecular das AGPs, é plausível que estes açúcares sejam essenciais para a função das AGPs. Foi proposto que as AGPs se ligam e armazenam cálcio (Ca2+) através dos resíduos de GkA no apoplasto, e as glucuronosiltransferases (GLCATs) são glicosiltransferases (GTs) que garantem a presença de GIcA nas AGPs. O objetivo geral da presente tese foi decifrar a importância funcional do GIcA das AGPs, esclarecer a conexão AGP-Ca,. e confirmar o papel sinalizador das AGPs como um armazenador dinâmico de Ca2+ na membrana plasmática. Este trabalho centralizou-se na caracterização funcional de GLCATs e prováveis GLCATs da familia GT14 em Arabidopsis thallana através de uma abordagem multidisciplinar que envolveu análise bioinformática e evolutiva, caracterização bioquímica, avaliação de localização subcelular das proteinas, análise de expressão genica e caracterização de fenótipos de mutante. As fusões fluorescentes das proteínas GT14 localizam-se no aparelho de Golgi quando expressas transitoriamente em Nicotiana benthamiana, exceto três proteinas que foram localizadas no retículo endoplasmático. Além disso, a reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) e a análise de fusões dos promotores com genes repórter mostraram que os genes GT14 foram amplamente expressos durante o desenvolvimento da flor em tecidos do pistilo, óvulos, estames, grãos de pólen e tubos polinicos. Ademais, os mutantes de GLCATs foram cultivados em meios deficiente e não deficiente em Ca2+, e os mutantes cultivados em meio deficiente em Ca2+, apresentaram múltiplos defeitos reprodutivos que foram suprimidos pelo aumento da concentração de Ca2+, no meio de crescimento. Finalmente, os resultados realçam a importância da porção de açúcares das AGPs e mostraram que a ligação do Ca2+ às AGPs é necessária para uma dupla fecundação bem-sucedida em Arabidopsis.

Seeds are the main source of human nutrition and are formed by a combination of two male and two female gametes (double fertilisation). Currently, an increase in agricultural production must be attained due to the ever-growing population scenario. Hence, a deeper understanding of cellular crosstalk that ensures reproductive success is critical. Arabinogalactan-proteins (AGPs) are highly gtycosylated proteins that are essential for the plant reproductive process. AGPs are extensively decorated with 90% of arabinogalactan polysaccharides composed of arabinose and galactose, and minor sugars such as glucuronic acid (GIcA), fucose, and rhamnose. Because sugars coat the molecular surface of AGPs, it is likely that these sugars are essential for AGP function. AGPs have been proposed to bind and store calcium (Ca2+) through GIcA residues in the apoplast, and glucuronosyltransferases (GLCATs) are glycosyltransferases (GTs) that ensure the presence of GIcA in AGPs. The overarching aim of the present thesis was to decipher the functional importance of GIcA of AGPs, clarify the AGP-Ca2+. connection, and confirm the signalling role of AGPs as a dynamic Ca2+, store in the plasma membrane. This work focused on functionally characterising GLCATs and putative GLCATs of the GT14 family in Arabidopsis Mariana through a multidisciplinary approach involving bioinformatics and evolutionary analysis, biochemical characterisation, protein subcellular localisation assessment, gene expression analysis, and mutant phenotype characterisation. GT14 fluorescent protein fusions were localised to the Golgi apparatus when transiently expressed in Nicodana benthamiana, except for three proteins that were localised in the endoplasmic reticulum. Moreover, quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) and promoter reporter fusion analysis showed that GT14 genes were widely expressed during flower development in pistil tissues, ovules, stamens, pollen grains, and pollen tubes. Furthermore, GLCATs mutants were grown in Ca2+, deficient and non-deficient media, and mutants grown in Ca2+; deficient medium had multiple reproductive defects that were suppressed by increasing the Ca2+. concentration in the growth medium. Finally, the results emphasised the importance of the sugar portion of AGPs and showed that Ca2+, binding by AGPs is required for successful double fertilisation in Arabidopsis.