Development of exosome-inspired nanovectors for RNA delivery

Abstract

As doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (DA), são uma preocupação crescente na saúde pública, como resultado da falta de tratamentos que impedem a progressão da doença e também, devido à complexa fisiopatologia da DA que ainda não é completamente compreendida. Sabe-se, no entanto, que a acumulação no cérebro das proteínas Aβ e Tau são marcas características da DA, tal como a elevada acumulação de espécies reativas de oxigénio e a maior atividade da acetilcolinesterase (AChE) nos neurónios. A terapia baseada no ácido ribonucleico (ARN) é uma ferramenta recente, que poderá mudar o padrão de tratamento de muitas doenças, incluindo a DA. No entanto, o ARN necessita de um sistema de entrega seguro e eficaz para ultrapassar todos os obstáculos inerentes à sua entrega, e para permitir uma acumulação e libertação direcionada no cérebro. Lipossomas miméticos de exossomas (Exo-lip) são nanopartículas lipídicas que combinam as características desejáveis quer dos exossomas naturais, quer dos lipossomas, sendo um sistemas híbrido de entrega de moléculas, com benefícios únicos. Além das moléculas de ARN, estes sistemas também podem transportar outras moléculas com propriedades terapêuticas, como compostos naturais com bioatividades de interesse para o tratamento da DA (por exemplo, curcumina e petrosamina). Para cumprir o objetivo principal desta tese, foram produzidos Exo-lip para entrega de ARN (siRNA ou mRNA), que foram caracterizados físico-quimicamente e testados, relativamente à sua estabilidade, em condições fisiológicas. Adicionalmente a internalização de Exo-lip, encapsulando siRNA e mRNA, foi confirmada na linha celular HEK293. Um modelo robusto de DA é um requisito essencial à compreensão dos mecanismos desta doença e, também, para testar medicamentos de modo eficaz. Deste modo, dois modelos de neurotoxicidade, induzida por alumínio, utilizando a linha celular de neuroblastoma SH-SY5Y e embriões de peixe-zebra, foram implementados para validar as diferentes terapias que se pretendiam testar. Estes modelos permitiram-nos confirmar a bioatividade dos Exo-lip, encapsulando siRNA anti-Tau e curcumina, na modulação de parâmetros que refletem as características da DA, como a atividade de AChE ou a expressão do gene Tau. Finalmente, a petrosamina isolada de uma esponja brasileira, por colaboradores do nosso grupo de investigação, foi testada diretamente nos dois modelos estabelecidos de DA, validando-a como um composto muito promissor para o tratamento desta doença, devido à sua elevada inibição da atividade da AChE.

Neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s Disease (AD) are a rising public health concern, as a result of the lack of treatments to stop disease progression, and of the complex pathophysiology of the disease that is not completely understood. Nevertheless, it is known that the accumulation of Aβ and Tau proteins in the brain are characteristic hallmarks of AD, along with higher accumulation of reactive oxygen species and higher activity of acetylcholinesterase in the neurons. RNA therapy is a rapidly expanding category of therapy that will change the standard of care for many diseases, including AD. However, RNA needs a safe and effective delivery system to mitigate all the hindrances inherent to its delivery, and to allow a targeted accumulation and release in the brain. Exosome-like liposomes are lipid nanoparticles that combine the desirable features of natural exosomes and liposomes, leading to an advanced delivery systems with unique benefits. Additionally, besides RNA molecules, these systems may also carry other therapeutic cargos, such as natural compounds with bioactivities of interest to AD treatment (e.g. curcumin and petrosamine). To accomplish the main objective of this thesis, exosome-like liposomes loaded with RNA (siRNA or mRNA) were produced, characterized physicochemically and their stability was tested in physiological conditions. The uptake of labelled exosome-like liposomes, encapsulating siRNA and mRNA, was confirmed in HEK293 cells. A robust AD model is a primary requirement to understand the underlying mechanisms of the disease and to conduct effective drug screening. Therefore, in this work, two AD-like aluminium induced neurotoxicity models, using the neuroblastoma cell line SH-SY5Y and zebrafish embryos, were implemented to validate the different therapeutic solutions we intended to test. This enables us to confirm the bioactivity of exosome-like liposomes, loaded with anti-Tau siRNA and natural compound curcumin, in modulating parameters that mirror hallmarks of AD, such as AChE activity or Tau gene expression, in the established in vitro and in vivo neurotoxicity models. Finally, petrosamine, which was isolated de novo from a Brazilian sponge by collaborators, was directly tested in the two established AD models, validating it as a very promising compound for AD treatment, due to its potent AChE activity inhibition.