First stage of the development of an Osteosarcoma in vitro model

Abstract

O osteossarcoma (OS) é o tipo de cancro ósseo mais comum, afetando principalmente os ossos longos de jovens (crianças e adolescentes). Atualmente, existem algumas terapias disponíveis, tais como a quimioterapia, que apesar do sucesso no tratamento da doença, apresentam graves efeitos secundários, como a cardiotoxicidade e insuficiência renal. A combinação destes fatores resulta num mau prognóstico para os pacientes e é neste sentido que surge a necessidade de desenvolver terapias mais eficientes com efeitos secundários menos exuberantes. No estudo de novos fármacos é crucial ter em consideração a política dos 3 R's para a experimentação animal, de modo a minimizar a quantidade de animais usados e, consequentemente, o tempo de experimentação e custos associados. Este projeto foca-se essencialmente no segundo R, a redução do número de animais envolvidos na experimentação animal. Esta redução só é possível através do desenvolvimento de um modelo in vitro de OS que possibilite a testagem de diversas moléculas terapêuticas de uma forma rápida e eficaz. Deste modo apenas as moléculas mais promissoras serão utilizadas em ensaios pré-clínicos mais avançados e implementadas em organismos vivos multicelulares. O desenvolvimento de um modelo de OS é complexo, dada a complexidade desta doença. Por sua vez, o osso é um tecido dinâmico com múltiplas interações entre diferentes células, como osteoblastos, osteoclastos e minerais essenciais, como o magnésio e o cálcio. Embora os modelos in vitro 2D permitam fazer alguns estudos, estes não mimetizam o multifacetado ambiente tumoral ósseo. Este projeto focou-se na primeira fase do desenvolvimento do modelo 3D, envolvendo as linhas celulares MG-63, SaOS-2, MC3T3-E1 e HEK-293. De modo a compreender melhor a interação entre as células ósseas e a matriz óssea, foram realizados ensaios de viabilidade celular e de análise do ciclo celular. Nestes ensaios foi avaliado o efeito do cálcio, magnésio e colagénio, juntamente com estímulos mecânicos, para analisar a capacidade piezoelétrica do osso. Verificou-se que não houve um impacto positivo significativo dos minerais e colagénio ao nível do ciclo celular e atividade metabólica. Relativamente ao impacto dos estímulos, será necessário otimizar este processo, de modo a obter resultados mais consistentes. Além disso, foi também avaliada a interação entre osteoblastos e osteoclastos. Verificou-se que houve um aumento de células nas fases S e G2/M em ambos os tipos de osteoblastos (MG-63 e MC3T3) quando tratados com o meio indutor de osteoclastos.

Osteosarcoma (OS) is the most common type of bone cancer, affecting mainly the long bones of children and young adults. Currently, there are some treatment options available, such as chemotherapy which, despite their success in treating the disease, have serious side effects, including cardiotoxicity and kidney failure. The combination of these factors results in a poor prognosis for the patients, and this is precisely why there is a need to develop more efficient therapies with less significant side effects. However, while searching for new approaches to treat OS, it is crucial to consider the 3 R’s policy for animal experimentation, to decrease the quantity of animals used and, consequently, minimize the experimentation time and associated costs. Therefore, this project focuses mainly on the second R - reduction in the number of animals involved in animal experimentation. Reduction is only possible through the development of an in vitro model of OS, that is able to incorporate several therapeutic molecules to be tested quickly and effectively. In this way, only the most promising molecules are used in more advanced pre-clinical trials and implemented in multicellular living organisms. The development of an OS model is complex, given the complexity of this disease. In turn, bone is a dynamic tissue with multiple interactions between different cells, such as osteoblasts, osteoclasts and essential minerals including magnesium and calcium. Although 2D in vitro models enable some research to be conducted, they do not mimic the multifaceted bone tumor environment. This project focused on the first phase of the development of the 3D model, involving the MG 63, SaOS-2, MC3T3-E1 and HEK-293 cell lines. In order to better understand the interaction between bone cells and the bone matrix, cell viability assays and cell cycle analysis were performed. In these tests, the effect of calcium, magnesium and collagen was evaluated, along with mechanical stimuli, to assess the piezoelectric capacity of the bone. It was verified that there was no positive significant impact of the minerals and collagen on the cell cycle and cells' metabolic activity. Regarding the impact of the stimuli, it will be necessary to optimize this process in order to obtain more consistent results. Furthermore, the interaction between osteoblasts and osteoclasts was also evaluated. It was verified that there was an increase in S and G2/M phases in both types of osteoblasts (MG-63 and MC3T3) when treated with the osteoclast-inducing medium.