On the role of a 5'-leader region in controlling the levels of the aromatic-responsive transcriptional activator DmpR

Abstract

Metabolically versatile bacteria play an important role in recycling carbon in the environment. For certain bacteria this metabolic versatility extends to seeming obnoxious toxic carbon sources such as aromatic compounds that can cause environmental pollution. One such example is Pseudomonas putida CF600 that carries the dmp-system for catabolism of dimethylphenols, mono-methylated phenols, and phenol on a catabolic plasmid. The dmpsystem consists of the dmp-operon encoding the specialized catabolic enzymes divergently transcribed from the dmpR gene. The dmpR gene encodes the aromatic-responsive transcriptional activator DmpR whose activity is strictly required for transcription of the dmpoperon. Because DmpR is a sensor-regulator that is activated upon binding substrates of the dmp-pathway enzymes, the dmp-system is always silent unless substrates are available. However, like other auxiliary catabolic pathways, regulation of expression of the Dmp-enzymes is also highly integrated within the host global regulatory network such that the system is also silent if more energetically favourable carbon sources are present. Failure to engineer such integration within host physiology has lead to unpredictable performance of artificial constructed catabolic pathways under field conditions. This provides a practical impetus to gain a greater understanding of the mechanisms involved. Much previous work had focused on the multiple roles of a bacterial alarmone that converge to stimulate activity of the promoter that drives transcription of dmpR to maximize performance of the dmp-system under lowenergy / stress conditions. However, the 5‟-leader region of the dmpR mRNA has also been implicated in playing a regulatory role. In this work, it is presented evidence, from in vivo and in vitro assays, that the DNA encoding the 5‟-leader region and the cognate region of the resulting mRNA exert control of the levels of DmpR by at least three different mechanisms: I) at the level of transcription through a ATAAATA motif within the 5‟-leader region DNA, II) at the level of translation by binding of Crc to the 5‟-leader region RNA, and III) by a less well defined, Crcindependent mechanism, that likely involved coupling of translation between a small openreading frame with the 5‟-leader region and that of the downstream dmpR gene. The results of these analysis and their physiological and mechanistic implications are discussed.

Bactérias metabolicamente versáteis são importantes na reciclagem de carbono no ambiente. Em algumas delas, a sua versatilidade abrange fontes de carbono aparentemente tóxicas, como compostos aromáticos, e causadoras de poluição ambiental. Um exemplo é a espécie Pseudomonas putida CF600 que possui o sistema dmp que permite o catabolismo de dimetil-fenois, metil-fenois e fenol. O sistema dmp consiste no operão dmp, que codifica enzimas catabolicas especializadas, e o gene dmpR divergentemente transcrito. Este último codifica o ativador transcriptional DmpR cuja atividade é estritamente necessária para ocorrer transcrição do operão. Sendo o DmpR um sensor / regulador apenas ativo após a ligação a substractos da via metabólica, o sistema dmp encontra-se sempre silenciado, exceto, quando substratos estão presentes. No entanto, como qualquer outra via metabólica auxiliar, a regulação da expressão das enzimas Dmp está também integrada nas vias regulatórias globais da célula; desta forma, o sistema é silenciado quando fontes de carbono mais favoráveis estão presentes. A falha em construir esta integração com a fisiologia do hospedeiro tem levado a resultados imprevistos por parte de vias catabólicas artificialmente construídas quando submetidas a condições de campo. Este facto impulsiona a obtenção de um melhor entendimento dos mecanismos envolvidos. Uma grande parte do trabalho previamente efetuado focou-se nos múltiplos papéis de uma alarmona bacterial, os quais convergem para estimular a atividade do promotor do gene dmpR, de modo a maximizar a performance do sistema em condições de baixa energia / stress. No entanto, a região 5‟ líder do mRNA do gene dmpR parece também estar implicada na regulação dos níveis da proteína. Neste trabalho, são apresentadas evidências, de ensaios realizados in vivo e in vitro, em como o DNA codificante desta região e a correspondente região do mRNA controlam os níveis de DmpR através de pelo menos 3 mecanismos: ao nível da transcrição através do motivo ATAAATA presente no DNA; ao nível da tradução através da ligação da proteína Crc ao mRNA e através de um mecanismo pouco definido mas que parece envolver a tradução acoplada entre uma pequena ORF (dentro da região 5‟ líder) e o gene dmpR. A discussão dos resultados desta análise, as implicações fisiológicas e os mecanismos associados são apresentados.