Development of multifunctional mannan nanogel

Abstract

Self-assembled nanogels made of hydrophobized mannan or pullulan were obtained using a versatile, simple, reproducible and low-cost method. In a first reaction pullulan or mannan were modified with hydroxyethyl methacrylate or vinyl methacrylate, further modified in the second reaction with 1-hexadecanethiol. The resultant amphiphilic material self-assembles in water via the hydrophobic interaction among alkyl chains, originating the nanogel. Structural features, size, shape, surface charge and stability of the nanogels were studied using hydrogen nuclear magnetic resonance, cryo-field emission scanning electron microscopy and dynamic light scattering. Above the critical micellar concentration (cmc), evaluated by fluorescence spectroscopy with Nile red and pyrene, spherical polydisperse nanogels reveal long-term colloidal stability in aqueous medium up to six months, with a nearly neutral negative surface charge and mean hydrodynamic diameter in the nanoscale range, depending on the polymer degree of substitution. Nanogel based on vinyl methacrylated mannan was selected for further characterization among others because its synthesis is much easier, cheaper and less time consuming, its cmc and size are smaller, it is less polydisperse, and more stable at pH 3–8, in salt or urea solutions being consequently more suitable for biological applications. Proteins (bovine serum albumin or ovalbumin) and hydrophobic drugs (curcumin) are spontaneously incorporated in the mannan nanogel, being stabilized by the hydrophobic domains randomly distributed within the nanogel, opening the possibility for the development of applications as potential delivery systems for therapeutic molecules. No cytotoxicity is detected up to about 0.4 mg/mL of mannan nanogel in mouse embryo fibroblast cell line 3T3 and mouse bone marrow-derived macrophages (BMDM) using cell proliferation, lactate dehydrogenase and Live/Dead assays. Comet assay, under the tested conditions, reveals no DNA damage in fibroblasts, which seems to occur in the case of BMDM. The internalization kinetics, uptake mechanisms and intracellular trafficking pathways of mannan nanogel in mouse BMDM was assessed by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy, using fluorescently conjugated nanogel. A time-, concentration- and energy-dependent uptake profile of the mannan nanogel is observed. Inhibition analysis unraveled mannose receptor-mediated phagocytosis and clathrin-mediated endocytosis to be involved in nanogel uptake. The mannan nanogel is also visualized in the cytosol suggesting that a fraction was able to escape from the endolysosomal system. The protein corona formed in human plasma around mannan nanogel was characterized by mass spectrometry after size exclusion chromatography or centrifugation followed by sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis. It consists of a very specific set of proteins, apolipoproteins B-100, A-I and E and human serum albumin, slowly formed following a dynamic protein exchange process. The mannan nanogel does not affect blood coagulation, does not induce complement activation and retards the fibril formation of both Alzheimer’s disease-associated amyloid β peptide and haemodialysis-associated amyloidosis β2 microglobulin, as was assessed by fluorometric thrombin generation assay, Western blot, and continuous thioflavin T fluorescence assay, respectively. Mannan nanogel has potential immunological adjuvant activity, as evaluated on the specific immune response to ovalbumin in intradermally immunized BALB/c mice. Elicited ovalbumin-specific antibodies were predominantly of IgG1 subclass indicating a T helper 2-type bias. Physicochemical characteristics, loading ability of biological agents, cytocompatibility and uptake of mannan nanogel by mouse BMDM, biosafety and biocompatibility studied at molecular level, and adjuvant activity are pronounced hints of the potential applicability of this nanosystem for macrophages targeted delivery of vaccines or drugs, acting as promising nanomedicines, always with the key goal of preventing and/or treating diseases

Nanogéis poliméricos auto-organizados foram obtidos a partir de manano e pululano hidrofobicamente modificados por um método versátil, simples, reprodutível e económico. Numa primeira reação, manano ou pululano foram enxertados com hidroxietil metacrilato ou vinil metacrilato, que por sua vez foram substituídos numa segunda reação com 1- hexadecanetiol. O material anfifílico resultante auto-organiza-se em água através da associação das cadeias alquílicas hidrofóbicas, originando o nanogel. As características estruturais, o tamanho, a forma, a carga de superfície e a estabilidade dos nanogéis foram estudados por espectroscopia de ressonância magnética nuclear 1H, microscopia crio-eletrónica de varrimento e dispersão dinâmica de luz. Acima da concentração micelar critica (cmc), avaliada por espectroscopia de fluorescência usando o vermelho de Nilo e o pireno, os nanogéis esféricos polidispersos revelam longa estabilidade coloidal em meios aquosos até seis meses, com carga de superfície negativa praticamente neutra, e diâmetro médio num intervalo nanométrico, cujo valor depende do grau de substituição do polímero. Dos nanogéis produzidos, o nanogel baseado em manano enxertado com vinil metacrilato foi selecionado para uma caracterização mais aprofundada porque a sua síntese é mais fácil, económica e rápida, a cmc e o tamanho são menores, é menos polidisperso e mais estável no intervalo de pH 3–8 bem como na presença de sal e ureia, sendo consequentemente mais apropriado para aplicações biológicas. Proteínas (albumina sérica bovina ou ovalbumina) e drogas hidrofóbicas (curcumina) são incorporadas espontaneamente no nanogel de manano, sendo estabilizados nos domínios hidrofóbicos aleatoriamente distribuídos no interior do nanogel, abrindo perspetivas para o desenvolvimento de aplicações em sistemas de libertação de moléculas terapêuticas. Nenhuma citotoxicidade é detetada com o nanogel de manano até 0.4 mg/mL na linha celular de fibroblastos de embrião de ratinho 3T3 e nos macrófagos derivados da medula óssea de ratinho usando ensaios de proliferação celular, lactato desidrogenase e “Live/Dead”. O ensaio cometa nas condições testadas, não revela dano no ADN dos fibroblastos, que possivelmente ocorre, no entanto, no caso dos macrófagos. A cinética de internalização, os mecanismos de internalização e as vias de tráfego intracelular do nanogel de manano nos macrófagos derivados da medula óssea de ratinho foram avaliados por citometria de fluxo e microscopia de confocal de varrimento laser, usando o nanogel conjugado com um fluorocromo. O perfil de internalização do nanogel é dependente do tempo, da concentração e de energia. A análise com inibidores revelou que a fagocitose mediada pelo receptor da manose e a endocitose mediada por clatrina estão envolvidos na internalização do nanogel. O nanogel de manano é também visualizado no citosol sugerindo que uma fração é capaz de escapar do sistema endolisossomal. A corona de proteínas formada no plasma humano em redor do nanogel de manano foi caracterizada por espectrometria de massa, após cromatografia de exclusão por tamanho ou centrifugação, seguidas de eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio. A corona consiste num conjunto específico de proteínas, apoliproteínas B-100, A-I e E e albumina sérica humana, que se forma após um lento e dinâmico processo de troca de proteínas. O nanogel de manano não afeta a coagulação do sangue, não induz ativação do complemento e retarda a formação de fibras do péptido β amiloide associado à doença de Alzheimer e de β2 microglobulina na amiloidose associada à hemodiálise, como foi avaliado por teste fluorimétrico de geração de trombina, Western blot e análise continua da fluorescência de tioflavina T, respectivamente. O nanogel de manano tem potencial atividade adjuvante, avaliada na resposta imune específica para ovalbumina em ratinhos BALB/c imunizados por via intradérmica. Os anticorpos específicos para ovalbumina induzidos foram predominantemente da subclasse IgG1, o que indica uma propensão para induzir uma resposta mediada por células “T helper” tipo 2. As características físico-químicas, a capacidade de incorporação de agentes biológicos, a citocompatibilidade e a internalização do nanogel de manano por macrófagos derivados da medula óssea de ratinho, a biossegurança e biocompatibilidade estudadas a nível molecular, e a atividade adjuvante deixam entrever a potencial aplicação deste nanosistema na libertação direcionada a macrófagos, quer de vacinas quer de fármacos, atuando como promissores nanomedicamentos, sempre com o objetivo chave de prevenir e/ou tratar doenças.