Saccharomyces cerevisiae strains expressing human KRAS as tools for targeting therapeutic anti-EGFR-RAS pathway antibody - drugs

Abstract

Fundamental cellular processes appear to be highly conserved between Saccharomyces cerevisiae and other more complex Eukaryotic species, including humans. “Humanized yeast systems” emerged as a tool to study molecular aspects of human pathologies. The present work aimed at contributing to build and validate a large high throughput platform of yeast strains displaying phenotypes that can enable further testing galectin-related drugs and peptides. This platform was designed to consist of two types of strains, the ones expressing human galectins and the ones expressing these together with the human KRAS cDNA. The rationale behind this relates with the putative dialogue between Galectins and RAS signaling pathway in mammals. Considering that EGFR mediates KRAS signaling and that yeast also harbors a RAS signaling pathway, the “humanized yeasts” expressing KRAS were used to identify the yeast target of anti-EGFR. Furthermore, it was also used for phenotyping the most well-known biological processes known to be controlled by RAS pathway. On the other hand, considering that the deletion of GUP1 in S. cerevisiae increases the resistance to the oncological drug Imatinib, the similarities between the phenotypes associated to the deletion of RAS and GUP genes were also verified. Two Hsp70, Ssa2p and Ssb2p and one glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Tdh3p, were identified as EGFR-like proteins. The subsequent alignments analysis between EGFR and these proteins revealed that Ssb2p and its very close homologue Ssa2p present some homology with EGFR sequence, namely at the level of three EGFR conserved amino acids known to be responsible for the interaction with the anti-EGFR antibody Cetuximab used in cancer treatment. This and other lines of evidence support Ssb2p and/or Ssa2p as good candidates for EGFR homology. The phenotypic tests revealed that both the deletions of GUP and RAS genes promote a reduction in chronological life span and cell size, except in the case of Δras2 strain, whose cells were bigger than wild type control. Nutrient depletion (carbon) promoted replication stress in Δras2 cells that failed to enter into G1 arrest, and were blocked in S phase, concurring with the bigger size of Δras2 cells and their short lifespan. Moreover, the cells with GUP genes deleted, in opposition to RAS mutants, showed ability to adhere to solid nitrogen-deficient medium. Neither RAS nor GUP mutants were able to invade or filament under these conditions. With this work we were able to determine the possible homologue of EGFR, many times associated with cancer pathologies, and contributed to gain insights on RAS and GUP genes common phenotypes. In conclusion, the present work opens doors to future discovery of new pathways in yeast, in addition to showing that S. cerevisiae is a suitable model to create a platform to explore therapeutic drugs/antibodies.

Vários processos celulares fundamentais encontram-se conservados entre a levedura Saccharomyces cerevisiae e outras espécies eucariotas mais complexas, incluindo humanos. A “Levedura humanizada” surgiu como uma ferramenta de estudo sobre aspectos moleculares de patologias humanas. Com este trabalho pretendeu-se contribuir para a construção e validação de uma plataforma de estirpes de levedura que exibam determinados fenótipos, permitindo o teste de drogas e péptidos relacionados com as galectinas. Esta foi planeada para incluir duas estirpes a expressar galectinas humanas, assim como o cDNA do KRAS humano. O propósito desta plataforma advém de uma possível interação entre as Galectinas e a via de sinalização dos RAS em mamíferos. Tendo em conta que o EGFR medeia a cascata de sinalização KRAS, e que também a levedura possui uma via de sinalização Ras, usou-se as leveduras humanizadas a expressar o KRAS para identificar o alvo do anti-EGFR. Para além disso, estas foram usadas para a fenotipagem de processos biológicos controlados pela cascata RAS. Por outro lado, tendo em conta que a deleção do GUP1 aumenta a resistência à droga oncológica Imatinib, verificouse também as semelhanças fenotípicas entre as deleções RAS e GUP. Foram identificadas duas proteínas Hsp70, Ssa2p e Ssb2p, e uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase Tdh3p, como sendo os alvos do anti-EGFR. Subsequentemente, a análise dos alinhamentos entre o EGFR e estas proteínas revelaram que a Ssb2p e a sua homóloga Ssa2p apresentam similaridade com a sequência do EGFR, nomeadamente ao nível de três aminoácidos responsáveis pela interação com o anticorpo anti-EGFR, Cetuximab, usado no tratamento do cancro. Esta informação suporta a hipótese das proteínas Ssb2p e/ou Ssa2p serem boas candidatas a homólogas do EGFR. Os testes fenotípicos revelaram que as deleções dos genes GUP e RAS promovem uma redução da longevidade cronológica e da área celular, com excepção para a estirpe Δras2 cujas células se revelaram maiores do que a wt. A depleção de nutrientes (carbono) induziu stress replicativo nas células Δras2, que por sua vez falharam a entrada na fase G1, ficando bloqueadas na fase S, o que está de acordo com o aumento da área celular e a baixa longevidade cronológica das células Δras2. Além disso, as células com a deleção nos genes GUP, contrariamente aos mutantes RAS, mostraram habilidade para aderir a um meio deficiente em nitrogénio. Nenhum dos mutantes RAS ou GUP foram capazes de invadir ou filamentar nas condições anteriormente descritas. Com este trabalho fomos capazes de determinar o possível homólogo do EGFR, muitas vezes associado a patologias relacionadas com o cancro, assim como contribuir para melhor compreender os fenótipos comuns associados aos genes RAS e GUP. Em conclusão, o presente trabalho abre portas para futuras descobertas de novas vias de sinalização em levedura, além de reforçar a utilização da S. cerevisiae como um bom modelo para criar uma plataforma de exploração de drogas/anticorpos.