A digital image based method to quantify intracellular polyphosphates in microbial aggregates

Abstract

Eutrophication is a serious problem of aquatic ecosystems that can threaten biodiversity and human health. It is caused by a high concentration of nutrients, such as phosphorus, leading to excessive growth of aquatic plants and, consequently, to stagnation and decreased levels of oxygen in water systems. To prevent this problem, wastewater from rural, industrial and urban backgrounds are treated using enhanced biological phosphorous removal. This technique uses microorganisms already present in wastewater that incorporate phosphorous into their cells in the form of polyphosphate, removing the nutrient from the water. A very important part of this technique consists of evaluating the polyphosphate levels present in the microorganisms, which is usually done through expensive or time consuming analytical methods. To improve the polyphosphate measurement step, the objective of this thesis was to create a quantitative image analysis program that can correlate image obtained data with analytical data, creating linear regression models useful for polyphosphate quantification. This program used color segmentation between polyphosphate and biomass regions, based on RGB, HSV and LAB color spaces, and was applied on images of samples dyed with different stains (methylene blue and toluidine blue) and with different dilution factors (no dilution and 10x dilution). These images experienced gamma values and contrast adjustments, to evaluate different image settings on color segmentation. Models for methylene blue stained and diluted samples presented the highest regression coefficients between the image data results and analytical data (0.920 and 0.992, respectively), also existing some differences between models of images with different contrast and gamma values. The color space chosen for image analysis seems to be very important with RGB and LAB presenting more satisfying results than HSV. More work is needed before this method can be used, however the results seen on this thesis are promising.

A eutrofização é um grave problema de ecossistemas aquáticos que pode ameaçar a biodiversidade e a saúde humana. É causada por uma alta concentração de nutrientes, tal como fósforo, levando a um crescimento excessivo de plantas aquáticas e, consequentemente, à estagnação e diminuição dos níveis de oxigênio nos sistemas de água. Para evitar este problema, as águas residuais das zonas rurais, industriais e urbanas são tratadas com recurso a remoção biológica de fósforo melhorada. Esta técnica utiliza microrganismos já presentes em águas residuais que incorporam o fósforo dentro das suas células na forma de polifosfato, removendo assim o nutriente da água. Uma parte muito importante desta técnica consiste em avaliar os níveis de polifosfato presentes nos microrganismos, o que é geralmente efetuado por métodos analíticos caros e demorados. Para melhorar a etapa de medição de polifosfatos, o objetivo desta tese foi criar um programa de análise quantitativa de imagem que pudesse correlacionar dados obtidos de imagens com dados analíticos, criando modelos de regressão linear úteis para a quantificação de polifosfatos. Este programa utilizou segmentação de cores entre regiões de polifosfato e biomassa, com base nos espaços de cores RGB, HSV e LAB, e foi aplicado em imagens de amostras tingidas com diferentes colorações (azul de metileno e azul de toluidino) e com diferentes fatores de diluição (sem diluição e diluição 10x). Estas imagens foram ajustadas nos seus valores de gamma e contraste, para avaliar diferentes configurações de imagem em segmentação de cor. Os modelos para amostras de azul de metileno e amostras diluídas apresentaram os maiores coeficientes de regressão entre os resultados dos dados de imagem e os dados analíticos (0,920 e 0,992, respetivamente), existindo também algumas diferenças entre os modelos de imagens com diferentes contrastes e valores de gamma. O espaço de cores escolhido para a análise de imagens parece ser muito importante, pois o RGB e o LAB apresentam resultados mais satisfatórios do que o HSV. Mais trabalho é necessário antes que este método possa ser usado, no entanto os resultados vistos nesta tese são promissores.