Preparation and characterisation of novel multifuncional chitosan-based membranes to modulate cell-material interactions

Abstract

A critical scarcity of donors and the high risk of graft rejection are the two major obstacles to the wide spreading of organ transplantation as an universal therapy for the substitution of organ, which underwent disease caused failure or irreversible accidental damaging. In order to overcome some of the limitations of the current therapies, several regenerative medicine concepts have emerged in the last few decades. One of those concepts, denominated guided bone regeneration (GBR), consists on the use of barrier membranes that prevent the in-growth of connective tissue, which in critical size defects inhibits the formation of new bone through the natural healing process. The first objective of this thesis was to develop biodegradable membranes based on chitosan and soybean protein exhibiting a biphasic structure, which would originate in situ porous formation, through a two step degradation mechanism. This application features some limitations and new approaches were designed seeking to widen the impact that the developed work could have in the regenerative medicine field. The tissue engineering field is likely to be the most paradigmatic example within the several regenerative medicine strategies born in the past decades. However, tissues and organs reconstruction have been often limited by these approaches, since tissue engineered constructs are very sensitive to a range of variables, which correlation is frequently not well understood or easily controllable. In order to overcome some of the limitations imposed by the use of supporting biodegradable materials, a new ingenious approach known as “cell sheet engineering” proved to succeed on recreating in vitro tissues with high therapeutic potential. Despite of the still relatively low number of the papers found in the literature about this issue, “cell sheet engineering” products are already reaching the clinical stage. This technology makes use of culture dishes grafted with thermo-responsive poly(Nisopropylacrylamide) (PNIPAAm) that undergo a transition at the lower critical solution temperature (LCST) from hydrophobic (above that value) to hydrophilic. At the culture temperature, grafted surfaces are slightly hydrophobic and cell adhesion and proliferation proceed as in conventional culture surfaces. Cultured confluent cell sheets spontaneously detach by merely reducing the temperature. In fact, the slightly hydrophobic surfaces are suitable for cell adhesion, while the more hydrated hydrophilic surfaces are not. The method is minimally invasive to the extracellular matrix (ECM), cell-to-cell and cell-to-ECM interactions, in opposition to the conventional enzymatic methods, which are deleterious to important biological structures such as ECM and cell membrane proteins. Despite of the great advances that have been already done on culturing and harvesting cell sheets from varied phenotypes, much less endeavour has been devoted to the creation of multifunctional novel thermo-responsive surfaces. In this thesis, several studies have been performed towards this goal, which are described in detail in Chapters 5, 6 and 7. First, we prepared chitosan membranes and studied the influence of crosslinking these membranes with glutaraldehyde in a range of different properties. We performed measurements of the mechanical properties with the samples immersed in an aqueous environment at 37ºC, in order to simulate physiological and cell culture conditions. Chitosan absorbs high amounts of water in aqueous solutions forming hydrogels. In this kind of systems, the determination of the mechanical properties in dry conditions has no practical meaning. Second, a preliminary cytotoxicity screening was performed in order to check if the materials would be suitable as implantable biomaterials, as well as for cell culture purposes. The tested membranes showed to be suitable for biomedical applications. Third, the transport properties of small molecules have been studied, showing that the membranes possess permeation properties that can be useful for the controlled delivery of bioactive agents, but also in combined strategies of growth and differentiation factors delivery and cell sheet engineering. Finally, PNIPAAm was grafted onto chitosan membranes to render surface with thermoresponsive properties. Those modified membranes showed to be suitable for cell culture, which can reach confluence and be thermally harvested by means of lowering the temperature. Single cell sheets can be layered in order to recreate thicker tissue-like constructs. However, the number of cell sheets that can be kept in culture is limited, because of restrictions on the delivery of nutrients and accumulation of metabolic wastes. It should be noticed that PNIPAAm grafted tissue culture polystyrene (TCPS) substrates commonly used to culture single cell sheets are impermeable. The use of chitosan membranes, which we found to be permeable to small molecules, would increase the mass transfer area for nutrients and metabolic wastes, hopefully supporting the culture of thicker layered cell sheet constructs. Furthermore, fully hydrated chitosan membranes should be easily adaptable to several anatomical shapes, owing to its flexible mechanical properties, facilitating the transfer of either single cell sheets or layered cell sheet constructs directly to the host site with minimal manipulation.

O elevado défice de doadores e o risco de rejeição impedem a banalização do transplante de órgãos como abordagem terapêutica. Nas últimas décadas têm sido propostas várias estratégias de investigação no campo da medicina regenerativa para tentar resolver estas limitações. A regeneração guiada de osso (GBR) é uma dessas estratégias e consiste no uso de membranas que proporcionam uma barreira à penetração de tecido conectivo no defeito ósseo, o que em lesões acima de uma determinada dimensão, impede o processo natural de regeneração. O primeiro objectivo desta tese foi desenvolver membranas biodegradáveis para este tipo de aplicações, combinando quitosano com proteína de soja, de forma a obter uma estrutura com duas fases. A diferente taxa de degradação de cada uma dessas fases originaria a formação de poros in situ. Ainda que bastante interessantes, estas aplicações possuem potencialidades de inovação algo limitadas, pelo que, outras estratégias foram implementadas ao longo do trabalho para alargar seu o impacto no campo da medicina regenerativa. A engenharia de tecidos humanos é provavelmente uma das estratégias mais paradigmáticas e representativas das revoluções recentes no campo da medicina regenerativa. Contudo, a reconstrução de tecidos e órgãos é muitas vezes limitada, uma vez que os implantes produzidos por engenharia de tecidos são muito sensíveis a um conjunto de variáveis cuja correlação é frequentemente obscura ou dificilmente controlável. Mais recentemente, uma estratégia inovadora, denominada em inglês “cell sheet engineering”, têm permitido recriar tecidos in vitro com elevado potencial terapêutico, evitando o uso de materiais de suporte biodegradáveis. De facto, embora seja relativamente recente, alguns produtos já foram testados clinicamente com sucesso. Esta tecnologia baseia-se no uso de superfícies modificadas com poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm). Este polímero possuí uma temperatura de transição em solução (LCST), conferindo à superfície carácter hidrofóbico acima da LCST e hidrofílico abaixo desse valor. Assim, superfícies modificadas com este polímero têm um carácter hidrofóbico nas condições de cultura celular, permitindo uma correcta adesão e proliferação. No entanto, diminuindo a temperatura abaixo da LCST o carácter da superfície passa a ser hidrofílico, induzindo o destacamento das células. Quando cultivadas até atingirem a confluência, ocorre uma separação espontânea de uma película de células contíguas ou “cell sheet”, conjuntamente com a matriz extracelular entretanto produzida por essas mesmas células. Este método permite a recuperação de estruturas biológicas importantes para o correcto funcionamento dos tecidos, em oposição aos métodos enzimáticos mais convencionais, que são bastante destrutivos. As grandes potencialidades deste método, já demonstradas para células de diversas origens e fenótipos, tornam bastante atractivo o desenvolvimento de superfícies que respondem à temperatura com outras funcionalidades inovadoras. Os diversos estudos desenvolvidos no âmbito desta tese com este objectivo estão detalhados nos capítulos 5, 6 e 7. Em primeiro lugar, prepararam-se membranas de quitosano e estudou-se a influência da reticulação dessas membranas com glutaraldeído em várias propriedades. As propriedades mecânicas destas membranas foram estudadas submergindo as amostras em soluções aquosas a 37ºC, de forma a simular as condições fisiológicas. O quitosano absorve quantidades consideráveis de água, sendo os materiais resultantes hidrogéis. Neste tipo de sistemas, a determinação das propriedades mecânicas com as amostras secas perderia o significado prático. Numa segunda fase foi feita uma avaliação preliminar da citotoxicidade dos materiais, o que demonstrou a sua potencial aplicabilidade como biomateriais e em culturas celulares. No passo seguinte estudaram-se as propriedades de transporte de pequenas moléculas, demonstrando-se que as membranas possuem valores de permeabilidade que podem ser úteis para aplicações de libertação controlada de agentes bioactivos, assim como, em estratégias que combinem a libertação controlada de factores de crescimento e diferenciação com as técnicas de “cell sheet engineering”. Por último, a PNIPAAm foi originalmente imobilizada à superfície das membranas de quitosano, de forma a que a superfície responda a alterações de temperatura. Estas membranas demonstraram ser adequadas para a cultura de células que, uma vez atingida a confluência, puderam ser separadas da superfície apenas reduzindo a temperatura. As “cell sheets” podem ser sobrepostas de forma a criar estruturas biológicas com maior espessura. No entanto, o número de “cell sheets” sobrepostas que se podem manter em cultura está limitado por restrições no fornecimento de nutrientes e pela acumulação de produtos metabólicos de excreção. As superfícies tipicamente usadas em “cell sheet engineering” consistem em PNIPAAm covalentemente imobilizado na superfície de placas de poliestireno de cultura celular. No entanto, estes materiais são impermeáveis. O uso de membranas de quitosano, permeáveis a moléculas de pequenas dimensões, aumentaria a eficiência na troca de nutrientes e produtos de excreção, permitindo eventualmente o aumento do número de “cell sheets” que se poderia sobrepor em cultura. Adicionalmente, as membranas de quitosano hidratadas poderão ser facilmente adaptáveis a formas anatómicas diversas, devido à sua elasticidade, facilitando a manipulação e a transferência directa de “cell sheets” individuais ou sobrepostas para o paciente.