Survival of drinking water pathogens to disinfection

Abstract

Legionella pneumophila is a waterborne pathogen, ubiquitous in natural aquatic environments. It is also commonly found in engineered waters when disinfection fails and is responsible for outbreaks and sporadic cases of Legionnaires’ disease worldwide. Conversely, the route of transmission of the gastric pathogen, Helicobacter pylori, is still unknown, but water has been recently considered a strong candidate for vehicle of transmission. A better knowledge on the survival strategies of these two pathogens to disinfection is therefore fundamental to achieve an efficient microbiological control of drinking water distribution systems (DWDS). These studies should however take into account that pipe surfaces of DWDS are colonized by heterotrophic populations of microorganisms that form structures denominated as biofilms, and that these biofilms might provide a protective haven for the survival of the pathogens studied here. As such, the aim of this work was to study the effect of chorine on L. pneumophila and H. pylori cells, both in suspension and when associated with heterotrophic biofilms. The role of several physicochemical parameters and of specific waterborne bacteria on the inclusion of these two pathogens into DWDS biofilms was also studied. In the study of the influence of chlorine on L. pneumophila (Chapter 2), pure cells of L. pneumophila NCTC 12821 were suspended in tap water and different concentrations of chlorine were added to obtain final chlorine concentrations of 0.0, 0.2, 0.7 and 1.2 mg l-1. Cells were then quantified by standard culture methods onto BCYE agar plates and by using a SYTO 9/Propidium Iodide-based viability kit. The cells exposed to 1.2 mg l-1 were also co-cultured with Acanthamoeba polyphaga. The results obtained showed that after exposure to low concentrations of chlorine, L. pneumophila can maintain viability even after a complete loss of cultivability, becoming viable but non-cultivable (VBNC). This condition was confirmed by the ability of L. pneumophila to recover cultivability after passage into amoebal cells. In Chapter 3, the influence of several physico-chemical parameters on the inclusion of autochthonous L. pneumophila into heterotrophic drinking water biofilms was studied. The experiments were conducted in a two-stage chemostat system, with the second stage consisting of three vessels working in parallel at 20ºC. In a second experiment the temperature of the second-stage was decreased to 15ºC. The biofilm was formed on uPVC coupons and total cells, total and cultivable L. pneumophila and cultivable heterotrophic microrganisms were quantified. Cultivable L. pneumophila was never recovered from biofilms or the planktonic phase but results obtained using a peptide nucleic acid (PNA) probe showed that this pathogen will easily embed into potable water biofilms independent of the conditions tested. Temperature seems to be the parameter that most influences L. pneumophila numbers within DWDS biofilms, with a higher incidence being obtained at 15ºC. To study the influence of low concentrations of chlorine on L. pneumophila associated to drinking water biofilms, chlorine was continuously fed to the second-stage chemostat to a final concentration of 0.2 and 1.2 mg l-1 (Chapter 4). The two concentrations of chlorine seem to have a little effect on the numbers of L. pneumophila cells, indicating that biofilms protect this pathogen from the oxidative stress of chlorine at concentrations higher than those commonly found in DWDS. In Chapter 5 results obtained for H. pylori NCTC 11637 using a similar culture system and conditions described for Chapter 3 are presented. The inclusion of H. pylori in drinking water biofilms was not influenced by any of the conditions tested (temperature, shear stress or carbon addition). It was also observed that the shape of H. pylori cells is temperature dependent, being predominantly spiral at 20ºC and coccoid at 15ºC. The observation of H. pylori in biofilms after 31 days of inoculation demonstrates that biofilms are an important ecosystem in the protection of H. pylori under stress conditions. The influence of chlorine on H. pylori cells both in suspension and associated to heterotrophic biofilms was studied (Chapter 6). The results showed that when in pure culture and suspension, H. pylori can completely lose cultivability without a significant loss of rRNA, possibly becoming VBNC. When associated to heterotrophic biofilms chlorine has also little effect on H. pylori. In Chapter 7, the results obtained for the influence of several waterborne heterotrophic bacteria on the survival of L. pneumophila and H. pylori in dual-species biofilms are presented. The bacterium Mycobacterium chelonae appears to have a crucial role in the increase of cultivability of both pathogens, indicating that a wider screening of microorganisms commonly present in water might identify species that support the survival of these two pathogens in DWDS. In the end of this work it is possible to conclude that disinfection by chlorine must be handled carefully as VBNC L. pneumophila and H. pylori might remain in suspension and associate with biofilms afterwards. In biofilms, cells are not only protected from residual chlorine but also in such a physiological condition that allows them to divide (L. pneumophila) or concentrate (H. pylori) within these structures. As a result, the release of biofilm to water due, for instance, to changing hydrodynamic conditions, might at times release an infectious dose of either pathogen, which should certainly be a subject of public health concern. Better ways to control water quality and the sloughing of biofilms are therefore needed.

A Legionella pneumophila é uma bactéria patogénica que pode ser frequentemente isolada em meios aquáticos naturais. Logo, pode também ser encontrada em águas potável, como resultado de uma desinfecção deficiente, o que a torna responsável quer por casos esporádicos, quer por surtos de doença do Legionário em todo o mundo. Pelo contrário, a via de transmissão do patogénico gástrico Helicobacter pylori continua por desvendar, sendo no entanto a água um forte candidato. Por esta razão, é fundamental compreender que estratégias permitem a estes dois patogénicos sobreviverem ao processo de desinfecção dos sistemas de distribuição de água potável (SDAP), permitindo, assim, adoptar medidas que visem o controlo eficaz da qualidade desta água. Salienta-se, no entanto, que estes estudos apenas estão completos quando também se considera o importante papel dos biofilmes que se formam nas tubagens dos SDAP e que representam um refúgio para estes microrganismos. O objectivo deste trabalho foi estudar o efeito do cloro livre em células em suspensão de culturas puras de L. pneumophila e H. pylori, bem como o efeito deste desinfectante nestes dois patogénicos quando associados a biofilmes heterotróficos. Foi ainda estudada a influência de diversos parâmetros físico-químicos e de determinadas bactérias isoladas de água potável na inclusão da L. pneumophila e da H. pylori em biofilmes. No estudo da influência do cloro em células de L. pneumophila, (Capítulo 2) foram preparadas suspensões puras de L. pneumophila NCTC 12821 em água da torneira previamente filtrada e adicionadas diferentes concentrações de cloro (0.0, 0.2, 0.7 and 1.2 mg l-1). A concentração de células foi avaliada por diferentes métodos que incluíram cultivo em placas de agar de BCYE e o uso de kit de viabilidade bacteriana SYTO 9/Iodeto de Propídio (PI). As células tratadas com 1.2 mg l-1 foram ainda co-cultivadas com Acanthamoeba polyphaga. Os resultados obtidos demonstraram que a exposição desta bactéria a baixas concentrações de cloro resultaram na perda de cultivabilidade sem no entanto ocorrer perda total de viabilidade, pelo que se pode concluir que estas células após contacto com este desinfectante entram no estado de viáveis mas não cultiváveis (VBNC) conseguindo recuperar a sua cultivabilidade após infectarem células de ameba. No Capítulo 3 foi estudada a influência de diversos parâmetros físico-químicos na inclusão de L. pneumophila autóctone em biofilmes de água potável. Para tal, utilizou-se um sistema de quimiostatos, cuja segunda parte era constituída por 3 fermentadores que trabalhavam em paralelo e a 20ºC. Numa segunda experiência diminuiu-se a temperatura de operação para 15ºC. A formação de biofilme foi promovida na superfície de cupões de uPVC e posteriormente removido para a quantificação de células totais, do número de células de L. pneumophila cultivável e total e bactérias heterotróficas cultiváveis. A recuperação de células de L. pneumophila cultiváveis nunca foi possível, quer da fase em suspensão quer dos biofilmes, no entanto o uso de sonda de PNA demonstrou que este patogénico pode facilmente ser incorporado em biofilmes heterotróficos independentemente das condições ambientais. Por outro lado, constatou-se uma maior incidência de L. pneumophila em biofilmes formados a 15ºC o que demonstra uma maior sensibilidade a variações térmicas. Foi ainda estudada a influência de concentrações baixas de cloro em células de L. pneumophila associadas a biofilmes, tendo-se para tal alimentado continuamente dois dos reactores do segundo estado com cloro obtendo-se uma concentração final dentro de reactor de 0.2 e 1.2 mg l-1 (Capítulo 4). Ambas as concentrações de cloro parecem ter um efeito insignificante na concentração de L. pneumophila associada a biofilmes indicando que este tipo de ambiente funciona como um refúgio para este patogénico ao efeito oxidativo do cloro. No Capítulo 5 utilizou-se o mesmo sistema descrito no Capítulo 3 tendo no entanto os fermentadores sido inoculados com H. pylori NCTC 11637. Verificou-se que nenhuma das condições estudadas (temperatura, tensão de corte ou aumento da concentração de carbono) influenciou significativamente a concentração de H. pylori dentro dos biofilmes. Contudo foi constatado que a forma fisiológica desta bactéria era predominantemente espiral a 20ºC enquanto que a 15ºC a maioria das células se apresentava sob a forma cocóide. Por outro lado, a recuperação do biofilme de H. pylori demonstra que estas estruturas representam um ecossistema importante que protege este patogénico de condições de stress. Foi também estudada a influência do cloro em células de H. pylori em suspensão e quando associadas a biofilmes heterotróficos (Capítulo 6). Os resultados demonstraram que este patogénico é capaz de perder completamente a cultivabilidade retendo contudo a viabilidade, tornando-se VBNC. Verificou-se ainda que este desinfectante tem um efeito desprezável em H. pylori associado a biofilmes heterotróficos. No Capítulo 7 são apresentados os resultados obtidos no estudo da influência de diversas bactérias isoladas de água potável na sobrevivência de L. pneumophila e H. pylori em biofilmes de duas espécies. Não foram obtidos todos os resultados pretendidos no entanto verificou-se que a bactéria Mycobacterium chelonae parece desempenhar um papel fundamental no aumento da cultivabilidade de ambos os patogénicos. No final deste trabalho é possível concluir que a desinfecção através do uso de cloro deve ser cuidadosamente estudada, uma vez que L. pneumophila e H. pylori no estado de VBNC podem permanecer em suspensão e associarem-se posteriormente a biofilmes. Dentro destas estruturas, as células não estão apenas protegidas do cloro residual como também são capazes de se multiplicar (L. pneumophila) ou concentrar (H. pylori). Como resultado, o desprendimento destas células para o fluído, devido por exemplo, à mudança das condições hidrodinâmicas, pode originar o aparecimento de doses capazes de causar infecções o que será, definitavamente, um problema de saúde púbica. Deste modo, é real a necessidade de um melhor controlo da qualidade da água e do desprendimento de biofilmes das paredes das tubagens de SDAP.