New insights in (ab)normal fetal lung development: predictive and mechanistic studies

Abstract

O desenvolvimento pulmonar é um complexo e desafiante tópico de pesquisa uma vez que, compreende diferentes zonas funcionais que diferem entre si em termos de nichos celulares e vias de sinalização. Estas zonas contribuem para a regulação da respiração neonatal normal. A hipoplasia pulmonar fetal (HPF) é caracterizada por pulmões pouco ramificados nos estadios iniciais e um reduzido número de ductos alveolares no final da gestação. Esta doença constitui uma das mais comuns causas de falha respiratória neonatal, para a qual o diagnóstico e tratamento pré-natal permanecem pouco conhecidos. Métodos imagiológicos e oclusão traqueal fetal endoscópica (FETO) são atualmente as ferramentas mais favoráveis para predizer e tratar a HPF, respetivamente. Contudo, os controversos valores preditivos por método imagiológico e os efeitos secundários associados com o FETO limitam a sua aplicabilidade. Tendo a sua máxima severidade na hérnia diafragmática congénita (HDC), a HPF é muitas vezes estudada no modelo da HDC induzida pelo nitrofen, o qual mimetiza de forma razoável a HDC humana no que concerne às alterações morfológicas e moleculares. No presente estudo pretendemos contribuir para o conhecimento do desenvolvimento pulmonar fetal. Para isso, exploramos o valor preditivo dos métodos imagiológicos na HPF letal; caracterizamos o pulmão hipoplásico fetal em termos de perfil epitelial celular da fase embriónica até à sacular e analisamos o papel funcional do Roundabout 1 (ROBO1) e ROBO2 na ramificação pulmonar e no perfil SRY-related HMG BOX (SOX2)/SOX9. Investigamos ainda os mecanismos desencadeados pelo fluido intraluminal que estimulam o crescimento pulmonar. Com esse intuito, avaliamos as culturas de explantes como modelo ex vivo para o estudo da composição do fluido intraluminal na ramificação pulmonar. Ao longo deste trabalho descrevemos os ultrassons como importantes preditores de HPF letal e recomendamos estudos restritos por tipo de doença e grau de severidade. Nos pulmões CDH-induzidos, verificamos um comprometimento do padrão próximo-distal e da diferenciação das células ciliadas na fase sacular. Identificamos o ROBO2 como estimulador da ramificação pulmonar via SOX9 e, descrevemos o ROBO2 como desregulado nos pulmões hipoplásicos. Demonstramos o fluido intraluminal como manipulável nas culturas de explantes pulmonares ex vivo e, reportamos a concentração de cloro intraluminal como promotor de crescimento celular num mecanismo dependente de PIEZO1/PIEZO2, expressos nas células pulmonares neuroendócrinas/corpos neuroepiteliais. Em conclusão, este trabalho contribui significativamente para o estado da arte do desenvolvimento pulmonar fetal e expõe novas perspetivas e possibilidades de investigação.

Fetal lung development is a complex and challenging topic of research since comprise distinct functional zones with unique cell niches and pathways that work together to permit normal respiratory function at birth. Fetal lung hypoplasia (FLH) with underbranched lungs at early and reduced number of alveoli at later development stages, constitute one of the most common causes of neonatal respiratory failure, for which the prenatal prediction and treatment remains uncertain. Imagiological methods and fetoscopic endoluminal tracheal occlusion (FETO) are the current more favorable approaches to predict and treat FLH, respectively. Nevertheless, the controversial predictive values by imagiological method and the inherent secondary effects after FETO restrain their applicability. Reaching its maximum severity in congenital diaphragmatic hernia (CDH), FLH is preferable studied in nitrofen-induced CDH rat model since it reasonably mimics the human CDH in terms of morphological and molecular alterations. In the present study, we intend to contribute to the body of knowledge in (ab)normal fetal lung development by exploring the predictive value of imagiological methods in lethal FLH estimation. In addition, we determine the epithelial cell profile from embryonic-to-saccular phases in induced-CDH lungs and evaluate the functional role of Roundabout 1 (ROBO1) and ROBO2 in branching morphogenesis and SRY- related HMG BOX (SOX2)/SOX9 profile. We then extend our studies to investigate the mechanisms triggered by intraluminal fluid in stimulation of fetal lung growth. For that, we evaluate the experimental relevance of the ex vivo lung explant cultures to study the intraluminal lung fluid composition in branching morphogenesis. In this Ph.D. thesis, we describe ultrasounds as valuable predictor for lethal FLH and recommend restrict studies by disease type and severity degree. In induced-CDH lungs, we provide evidence that both proximodistal patterning and the differentiated profile of ciliated cells at saccular stage are impaired. We identify ROBO2 as promotor of SOX9 instead of SOX2 expression in branching morphogenesis and describe ROBO2 as dysregulated in hypoplastic lungs. Lastly, we demonstrate the intraluminal fluid able to be manipulated in ex vivo lung explant cultures, for which the intraluminal chloride concentration is modulator of ex vivo lung growth under a mechanism dependent on PIEZO1/PIEZO2, expressed in pulmonary neuroendocrine cells/neuroepithelial bodies. In conclusion, this work significantly contributes to the state-of-the-art in (ab)normal fetal lung development and exposes new perspectives and possibilities for research.