Evaluation of drug loaded magnetoliposomes as multifunctional platforms for advanced cell therapies

Abstract

O cancro é a principal causa de morte a nível mundial. Apesar dos avanços alcançados na área, a deterioração progressiva da qualidade de vida dos doentes urge a procura de novas estratégias de tratamento. Assim, este trabalho centrou-se no desenvolvimento e otimização de magnetolipossomas enquanto nanotransportadores de agentes quimioterápicos e na avaliação in vitro da seu desempenho terapêutica em meios miméticos ao ambiente tumoral e numa linha celular de interesse. Inicialmente, sintetizaram-se nanopartículas (NPs) superparamagnéticas esféricas de ferrite de magnésio e cálcio (CaxMg1-xFe2O4, com x=0,25; 0,50 e 0,75) e estudaram-se os efeitos da variação destes elementos nas suas propriedades. O maior potencial das NPs de Ca0.25Mg0.75Fe2O4 instigou o desenvolvimento de uma nova metodologia de síntese com anisotropia de forma, de modo a potenciar a sua magnetização de saturação em relação às homólogas esféricas. Estas revelaram potencial em mediarem o estímulo térmico sob campo magnético alternado e irradiação de laser infravermelho. Posteriormente, testou-se a incorporação das NPs em magnetolipossomas aquosos (AMLs) e sólidos (SMLs), sendo que os SMLs se revelaram mais promissores. Da mesma forma, desenvolveu-se um novo método de síntese de SMLs para aumentar a quantidade de NPs por vesícula lipídica. Este método permitiu a reprodutibilidade de síntese de SMLs baseados em múltiplas combinações lipídicas com propriedades estruturais e coloidais adequadas para aplicação biomédica. A otimização de SMLs avançou no sentido de lhes conferir capacidade de libertar doxorrubicina (DOX) sob a presença de múltiplos estímulos (fusogénicos, temperatura e de pH). Assim, foram quantificados sistematicamente os efeitos de nove combinações lipídicas nos perfis de libertação da DOX sob condições miméticas às fisiológicas (37 °C e pH=7,4) e em condições terapêuticas (42 °C e/ou pH ácido). Este processo permitiu selecionar a combinação lipídica com maiores taxas de libertação nas condições terapêuticas. O efeito da DOX livre e encapsulada em SMLs (2 mg de NPs em 1 mM de formulação lipidica) foi avaliado na linha celular Sk-br-3 do cancro da mama, cultivada em diferentes níveis organizacionais celulares (2D e 3D). Por fim, plataformas microfluídicas foram fabricadas para retenção de esferóides de Sk-br-3 que visa a simulação de gradientes espacio-temporais do microambiente tumoral heterogéneo. Em suma, este trabalho apresenta uma abordagem multidisciplinar no desenvolvimento e otimização de magnetolipossomas enquanto nanotransportadores multifuncionais para tratamento de tumores sólidos. Reforça ainda a importância de estabelecer métodos de cultura celular miméticos ao contexto in vivo na validação rigorosa de novas estratégias de tratamento.

Cancer is the leading cause of death worldwide. Despite the advances in the area, the progressive deterioration of patients' quality of life urges the search for new treatment strategies. Thus, this work focused on developing and optimizing magnetoliposomes as nanocarriers of chemotherapeutic agents and evaluating their in vitro therapeutic performance in tumoral mimetic environments in a suitable cell line. Initially, spherical superparamagnetic nanoparticles (NPs) of magnesium and calcium ferrite (CaxMg1- xFe2O4, with x=0.25; 0.50 and 0.75) were synthesized, and the effects of varying these elements on their properties were studied. The more significant potential of Ca0.25Mg0.75Fe2O4 NPs prompted the development of a new synthesis methodology with shape-anisotropy to enhance its magnetic properties in relation to its spherical counterparts. The developed NPs demonstrated the potential to obtain a thermal stimulus under alternating magnetic fields and infrared laser irradiation. Subsequently, the incorporation of NPs in aqueous magnetoliposomes (AMLs) and solid magnetoliposomes (SMLs) was evaluated, and the SMLs proved to be more promising systems. Likewise, a new method of synthesizing SMLs was developed to increase the amount of NPs per lipid vesicle. This method allowed the synthesis reproducibility of SMLs based on multiple lipid combinations with structural and colloidal properties suitable for biomedical applications. Furthermore, the optimization of SMLs allowed to induce the ability to release doxorubicin (DOX) under the presence of multiple stimuli (fusogenic, temperature and pH). Thus, the effects of nine lipid combinations on DOX release profiles were systematically quantified under physiological conditions (37°C and pH=7.4) and under therapeutic conditions (42°C and/or acidic pH). This process allowed the selection of the lipid combination with the highest release rates under therapeutic conditions. Furthermore, the effect of free and encapsulated DOX in SMLs (2 mg of NPs in 1 mM of lipid formulation) was evaluated on the Sk-br-3 breast cancer cell line cultured at different cell organizational levels (2D and 3D). Finally, microfluidic platforms for the retention of Sk-br-3 spheroids were designed, aiming to simulate space-time gradients of the heterogeneous tumour microenvironment. Overall, this work presents a multidisciplinary approach to the development and optimization of magnetoliposomes as multifunctional nanosystems for the treatment of solid tumours. It also reinforces the importance of establishing mimetic cell culture methods to the in vivo context, allowing to validate the accuracy of new treatment strategies for the disease.