Induction of premature senescence in human fibroblasts through endoplasmic reticulum stress: protection by phenolic diterpenes

Abstract

Population ageing is increasing worldwide due to the increase of lifespan and to sociological reasons. This is however associated with a higher incidence of age-related chronic disorders, such as neurodegenerative and cardiovascular diseases, diabetes and cancer. Therefore, new approaches to promote a healthy ageing are needed. The accumulation of damaged and misfolded proteins are present during the ageing process and known to be associated with endoplasmic reticulum (ER) stress and to the progression of many age-related diseases. Based on this, an in vitro method to induce premature senescence in normal human fibroblasts through induction of ER stress was developed in the present study in order to test potential anti-ageing compounds that acts by dealing with protein damage and associated ER stress. Tunicamycin (TUN) was successfully used to induce ER stress in normal diploid human skin fibroblasts since it triggered the unfolded protein response (UPR) signaling, as shown by the up-regulation of BiP, ATF6- α, CHOP and spliced XBP1. Treatment of fibroblasts with TUN significantly inhibited cell growth without inducing cell death (even by apoptosis), and it affected cell morphology in a way that resembled a senescent phenotype. Induction of premature senescence was confirmed by the appearance of several markers of cellular senescence, such as induction of G1 arrest, presence of SA β-Gal positive cells, increased cells’ green autofluorescence and expression of p16. Finally, this model was used to test the potential protective effect of carnosic acid - a natural phenolic diterpene. Although preliminary, the results suggested us that carnosic acid is able to prevent against the TUN-induced premature senescence corroborating the anti-ageing potential of this compound shown by previous results from the group. This work contributed to the development of a new model of induction of premature senescence in human fibroblasts, which can then be used to test compounds applicable for nutritional ageing interventions.

O envelhecimento da população está a acontecer de uma forma crescente devido ao aumento da esperança média de vida e por razões sociais. Contudo, este fenómeno está associado ao aumento da incidência de doenças crónicas relacionadas com o envelhecimento, tais como doenças neurodegenerativas e cardiovasculares, diabetes e cancro. Portanto, novas abordagens são necessárias de modo a promover um envelhecimento saudável. A acumulação de proteínas danificadas está presente durante o processo de envelhecimento e é reconhecido a sua associação ao stress do retículo endoplasmático (ER) e com a progressão de muitas doenças relacionadas com o envelhecimento. Deste modo, no presente estudo foi desenvolvido um método in vitro de indução de senescência prematura em fibroblastos humanos normais através da indução de stress do ER, de modo a testar compostos com potencial anti-envelhecimento que atuam por modulação dos níveis de proteínas danificadas e o associado stress do ER. A tunicamicina (TUN) foi usada com sucesso em fibroblastos diplóides normais isolados de pele humana para indução de stress do ER, uma vez que ativou a unfolded protein response (UPR) demonstrado pelo aumento observado da expressão de BiP, ATF6-α, CHOP e spliced XBP1. O tratamento dos fibroblastos com TUN inibiu significativamente o crescimento celular sem, porém, induzir morte celular (incluindo apoptose), mas afetou significativamente a morfologia das células de tal modo que mimetizava um fenótipo de senescência. A indução de senescência prematura foi confirmada através da presença de diversos marcadores de senescência celular, tais como a indução da paragem do ciclo celular em G1, presença de células marcadas com β-Gal, aumento da autofluorescência verde e da expressão de p16. Finalmente, este modelo foi usado para testar os potencias efeitos protetores do ácido carnósico - um diterpeno fenólico. Embora preliminares, os resultados sugerem que este composto previne contra a senescência prematura induzida pela TUN, corroborando assim o seu potencial efeito anti-envelhecimento anteriormente demonstrado pelo grupo. Este trabalho contribuiu para o desenvolvimento de um novo modelo de indução de senescência prematura em fibroblastos humanos, o qual pode ser usado para testar compostos aplicáveis em intervenções nutricionais para o envelhecimento.