Tailoring Asparaginases for the treatment of Acute Lymphoblastic Leukemia

Abstract

A L-asparaginase (ASNase) é fundamental no tratamento da Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA), um tipo de cancro que afeta principalmente crianças e representa uma proporção significativa dos diagnósticos pediátricos de cancro em todo o mundo. Apesar dos seus comprovados benefícios clínicos, o uso terapêutico da ASNase é limitado por vários motivos, incluindo a sua curta meia-vida, potencial imunogenicidade e efeitos adversos, como a hiperamonemia, uma condição que resulta da libertação e acumulação de amónia durante a hidrólise da asparagina catalisada pela ASNase. Estas limitações exigem abordagens inovadoras para melhorar a sua estabilidade, reduzir as respostas imunogénicas e mitigar os efeitos colaterais, mantendo a eficácia terapêutica. Este trabalho explorou duas estratégias complementares para aprimorar as formulações de ASNase. A primeira estratégia envolveu a engenharia genética da ASNase, fundindo polímeros do tipo elastina (ELPs) à enzima, utilizando ferramentas de biologia molecular. No entanto, as proteínas resultantes não apresentavam o peso molecular esperado, eram maioritariamente insolúveis e não exibiram atividade enzimática. Como abordagem alternativa, uma ASNase comercial foi encapsulada em partículas de queratina derivadas de cabelo virgem e/ou de cabelo descolorido, utilizando dois métodos distintos – homogeneização por alta pressão e ultrassonicação. As partículas produzidas por homogeneizador de alta pressão apresentaram tamanhos menores e, portanto, mostraram-se mais adequadas para aplicações clínicas em comparação com aquelas produzidas por ultrassonicação. As partículas foram rigorosamente caracterizadas em termos de tamanho, potencial zeta e atividade enzimática,tendo as partículas produzidas por homogeneizador de alta pressão demonstrado capacidade para reter a amónia libertada durante a hidrólise da asparagina, revelando potencial para controlar e evitar a hiperamonemia. Testes de citotoxicidade in vitro utilizando células HaCaT e estudos in vivo com larvas de Galleria mellonella confirmaram a biocompatibilidade das nanopartículas de queratina encapsulando a ASNase, indicando a sua segurança para futura aplicação terapêutica. No entanto, os resultados destacam a necessidade de uma otimização significativa para aumentar o seu potencial terapêutico. Pesquisas futuras devem focar-se no refinamento dos métodos de síntese das partículas para alcançar tamanhos mais uniformes, estudar condições que melhoram e que afetam a retenção da amónia e aumentar a estabilidade da ASNase encapsulada ao longo do tempo.

L-asparaginase (ASNase) is fundamental in the treatment of Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL), a type of cancer that primarily affects children and accounts for a significant proportion of pediatric cancer diagnoses worldwide. Despite its proven clinical benefits, the therapeutic use of ASNase is limited by several drawbacks, including its short half-life, immunogenicity, and adverse effects such as hyperammonemia — a condition resulting from the release of ammonia during asparagine hydrolysis. These limitations necessitate innovative approaches to improve its stability, reduce immunogenic responses, and mitigate side effects while maintaining therapeutic efficacy. This work explored two complementary strategies to enhance ASNase formulations. The first strategy involved the genetic engineering of ASNase by fusing elastin-like polymers (ELPs) to the enzyme using molecular biology tools. However, the resulting proteins did not present the expected molecular weight, were insoluble and did not exhibit enzymatic activity. As an alternative approach, a commercial ASNase was encapsulated into keratin particles derived from virgin and bleached hair. Particles produced via high-pressure homogenization exhibited smaller sizes and were therefore more suitable for clinical applications compared to those produced by sonication. The particles were rigorously characterized in terms of size, zeta potential, and enzymatic activity. The particles produced via high-pressure homogenization demonstrated the ability to retain ammonia released during asparagine hydrolysis, thus showing potential for application in cases of hyperammonemia. In vitro cytotoxicity tests using HaCaT cells and in vivo studies with Galleria mellonella larvae confirmed the biocompatibility of keratin particles, indicating their safety for further development. However, the results highlighted the need for significant optimization to enhance their therapeutic potential. Future research should focus on refining particle synthesis methods to achieve more uniform sizes, investigating the conditions that improve and affect ammonia retention, and increasing the stability of encapsulated ASNase over time.