Metabolic engineering for the production of branched-chain fatty acids from D-xylose in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Os ácidos gordos de cadeia ramificada (BCFAs) são um grupo específico de ácidos gordos e são produtos de grande interesse dado as recentes aplicações clínicas descobertas. Os ácidos gordos são sintetizados em vários organismos, incluindo a Saccharomyces cerevisiae. As leveduras utilizam princi palmente a glucose como principal fonte de carbono. No entanto, existem outras alternativas como a xilose, que é abundante na biomassa lignocelulósica. Ainda assim, esta espécie de levedura não tem a capacidade de assimilar naturalmente a xilose. Por isso, são necessárias estratégias de engenharia me tabólica para obter estirpes de levedura capazes de assimilar xilose e crescer eficientemente em meios contendo xilose. O intuito da engenharia metabólica é modificar o metabolismo celular para promover ou melhorar o consumo de substratos e a produção de metabolitos. Uma estratégia é a expressão heteróloga da via da xilose isomerase (XI) para converter a xilose em xilulose, que pode ser metabolizada pelas leve duras. Neste trabalho, estirpes de levedura foram transformadas com um plasmídeo usado como vetor de expressão contendo a cassete de expressão da XI. Além disso, integração genómica desta via foi ten tada pelo método CRISPR/Cas9. Após a expressão da via XI, as leveduras foram submetidas a evolução laboratorial adaptativa para melhorar o consumo da xilose e o crescimento em meios com este açúcar. As leveduras foram também evoluídas sob depleção de nitrogénio para aumentar a acumulação de lípidos. Neste trabalho, a expressão heteróloga da via XI e a evolução adaptativa levaram ao desenvolvimento de estirpes de levedura consumidoras de xilose. A combinação de vias heterólogas para a consumo de xi lose com a produção de ácidos gordos expandiria as aplicações da engenharia metabólica em leveduras, levando a um processo sustentável de produção de combustíveis e outros produtos químicos.

Branched-chain fatty acids (BCFAs) are a specific group of fatty acids and are products of great interest since clinical applications were recently found. Fatty acids are synthesized in various organisms, including the Saccharomyces cerevisiae yeast. Yeasts uses mainly glucose as the main carbon source. Nevertheless, there are other alternatives like xylose, which is abundant in lignocellulosic biomass. However, this yeast specie does not have the ability to naturally assimilate xylose. Therefore, metabolic engineering strategies are required to obtain yeast strains capable to assimilate xylose and grow efficiently on xylose-containing media. The aim of metabolic engineering is to modify the cellular metabolism to enable or improve the substrate consumption and metabolite production. One strategy is the heterologous expression of xylose isomerase (XI) pathway to convert xylose into xylulose, which can be metabolized by yeasts. In this work, yeast strains were transformed with a plasmid used as an expression vector containing the XI expression cassette. Besides, the genomic integration of XI pathway was also attempted by the CRISPR/Cas9 method. After the expression of the XI pathway, yeasts were subjected to adaptive laboratorial evolution to improve the xylose consumption and growth on xylose-containing media. In addition, yeasts were evolved under nitrogen depletion in order to enhance the lipid accumulation. In this work, the heterologous expression of XI pathway and the adaptive evolution led to the development of xylose-consuming yeast strains. The combination of heterologous pathways for the xylose consumption with the production of fatty acids would expand the applications of metabolic engineering in yeasts, leading to an sustainable process for the production of fuels and other chemicals.