Production of bio-oils from lignocellulosic raw-materials by oleaginous yeasts resistant to inhibitory compounds

Abstract

A biomassa lignocelulósica (BL) e as macroalgas destacam-se como matérias-primas sustentáveis e de baixo custo, com elevado potencial de integração em biorrefinarias. A produção de biocombustíveis, como o biodiesel, depende tradicionalmente de óleos vegetais; no entanto, os lípidos microbianos produzidos por leveduras oleaginosas são alternativas promissoras. O presente trabalho teve como objetivo a produção sustentável de lípidos microbianos da levedura Yarrowia lipolytica, utilizando BL e macroalgas como substratos. Inicialmente, foram testadas estirpes de Y. lipolytica quanto à sua tolerância a compostos inibitórios e capacidade de acumular lípidos. As estirpes selecionadas (W29 e NCYC 2904) foram de seguida estudadas em culturas descontínuas com meios que mimetizavam hidrolisados de BL. A estirpe NCYC 2904 apresentou a maior acumulação lipídica (53 %, m/m), enquanto a estirpe W29 produziu a maior concentração de ácido cítrico (44 g·L-1). Os maiores rendimentos em biomassa e lípidos foram obtidos em culturas descontínuas repetidas em duas fases (C/N 10 na 1ª fase e 75 na 2ª fase) com a estirpe NCYC 2904. Foram usados hidrolisados de casca de eucalipto como prova de conceito em hidrolisados reais de BL e foram estudados os efeitos da concentração de açúcares, razão C/N, condições de oxigenação e modo de operação na produção de lípidos pela estirpe W29. Foram também utilizadas podas de oliveira através de 3 estratégias diferentes combinando hidrólise enzimática e produção de lípidos. A estratégia de sacarificação simultânea seguida de produção de lípidos revelou os melhores resultados, tendo-se alcançado 43 g·L-1 de lípidos (48 %, m/m) com a estirpe NCYC 2904, o valor mais elevado até à data reportado para produção de lípidos a partir de BL por leveduras. Os lípidos de ambas as estirpes, com mais de 77 % de ácidos gordos insaturados e semelhantes aos óleos vegetais, são uma matéria-prima promissora para biocombustíveis. Foram ainda preparados e usados hidrolisados das macroalgas Fucus vesiculosus e Palmaria palmata no crescimento da estirpe NCYC 2904, que consumiu fucose e ácido glucurónico, e assimilou xilose mais rapidamente do que glucose, comportamentos nunca antes reportados. Ocorreu produção de eritritol (40 g·L-1), mas a acumulação de lipídios foi baixa. Esta tese demonstra a versatilidade de Y. lipolytica na valorização de biomassas lignocelulósicas e de macroalgas para a produção de lípidos, metabolitos e biomassa proteica, reforçando o seu potencial para aplicação em indústrias de biocombustíveis, alimentares e de rações.

Lignocellulosic biomass (LB) and seaweeds attracted significant attention as sustainable and low-cost feedstocks with potential for integration into biorefinery platforms. Biofuels production, such as biodiesel, relies on vegetable oils; however, microbial lipids from oleaginous yeasts are promising alternatives. This thesis aimed to develop sustainable production of microbial lipids by the yeast Yarrowia lipolytica using LB and seaweeds as feedstocks. Firstly, Y. lipolytica strains were screened based on their tolerance to inhibitory compounds and on intracellular lipids accumulation. Then, batch cultures of the selected strains W29 and NCYC 2904 were performed in medium mimicking LB hydrolysates. The Y. lipolytica NCYC 2904 exhibited the highest lipids accumulation ability (53 %, w/w) while the strain W29 produced the highest citric acid (44 g·L-1) concentration. Repeated-batch cultures markedly enhanced lipids concentrations, but the highest biomass and lipids yields were achieved in two-stage repeated-batch experiments with NCYC 2904, using a C/N ratio of 10 in the 1st batch and 75 in the 2nd batch. Eucalyptus bark hydrolysates were used as proof-of-concept of real LB hydrolysates, and the effects of sugar concentration, C/N ratio, oxygenation conditions, and operation mode on lipids production by Y. lipolytica W29 were investigated. Olive tree prunings (OTP) were also explored as LB. OTP pretreatment and bioconversion were tested under separate hydrolysis and lipids production (SHLP), pre-saccharification and simultaneous saccharification and lipids production (PSSLP), and simultaneous saccharification and lipids production (SSLP) using the strain NCYC 2904. A production of 43 g·L-1 of lipids (48 %, w/w) in SSLP was obtained, which is the highest reported to date for yeast-based lipids production from LB. Lipids from both strains contained more than 77 % unsaturated fatty acids, resembling vegetable oils and confirming suitability for biofuels. Seaweeds’ hydrolysates (Fucus vesiculosus and Palmaria palmata) were also prepared and successfully used to grow Y. lipolytica NCYC 2904. For the first time reported, the yeast consumed fucose and glucuronic acid and assimilated xylose faster than glucose. Erythritol was produced at 40 g·L-1, but lipids production was low. Overall, this thesis shows the versatility of Y. lipolytica to valorize lignocellulosic and seaweeds feedstocks into microbial lipids, citric acid, erythritol, and proteinrich biomass, underscoring its potential for the biofuels, food, and feed industries.