Development of molecular and imaging tools to study SUMO conjugation in plants

Abstract

A conjugação do Pequeno Modificador Semelhante à Ubiquitina (SUMO) é um mecanismo molecular presente em todos os eucariotas e fornece um nível extra de controlo dos processos celulares na forma de modificação pós-translacional de proteínas. Esta modificação modula a função das proteínas-alvo às quais o SUMO se liga (também conhecido como SUMOlação), resultando na regulação de múltiplos processos fisiológicos, como as respostas ao stress das plantas. O papel crítico da SUMOlação vegetal é ilustrado pelo seu papel essencial durante as fases iniciais do desenvolvimento das sementes. O principal objetivo deste projeto é descobrir a regulação de uma enzima importante da maquinaria SUMOlação, a grande subunidade da enzima ativadora SUMO E1 SAE2. Resultados anteriores identificaram que o domínio C-terminal de SAE2 é processado, embora o mecanismo que intervém neste processamento seja desconhecido. Para atingir este objetivo, explorou-se uma abordagem experimental baseada na técnica de Transferência de Energia por Ressonância de Förster (FRET), que permite a realização de estudos de alto rendimento. FRET envolve a transferência de energia entre uma molécula fluorescente dadora que é excitada e emite a energia que irá excitar uma segunda molécula, recetora, que emite a energia que pode ser lida e medida. O delineamento experimental utilizou uma proteína recombinante constituída por um doador e um recetor de proteínas fluorescentes separadas pelo domínio SAE2 que é alvo de uma atividade proteolítica (dador-SAE2-recetor). Consequentemente, se uma protéase clivar esse domínio SAE2, dador e recetor será dividido, e FRET não ocorrerá. Após vários ensaios, a configuração do ensaio FRET não foi possível, e uma nova estratégia foi desenvolvida baseada em eletroforese em gel não desnaturante. Utilizando este método, foi possível observar a presença de atividade de processamento de SAE2 em extratos proteicos de siliques. Apesar deste resultado positivo observado no gel e do seu potencial, esta técnica deve ser melhorada.

The conjugation of Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO) is a molecular mechanism present in all eukaryotes and provides an extra level of control of cellular processes in the form of post-translational modification of proteins. This modification modulates the function of the target proteins to which SUMO binds (also known as SUMOylation), resulting in the regulation of multiple physiological processes, such as plant stress responses. The critical role of plant SUMOylation is illustrated by its essential role during the early stages of seed development. The main goal of this project is to uncover the regulation of a critical enzyme of the SUMOylation machinery, the large subunit of the SUMO E1 activating enzyme SAE2. Previous results identified that SAE2 C-terminal domain is processed, although the mechanism that mediates this processing is unknown. To address this objective, we have explored an experimental approach based in the Förster Resonance Energy Transfer (FRET) technique, which allows performing high-throughput studies. FRET involves the transfer of energy between a donor fluorescent molecule that is excited and emits the energy that will excite a second molecule, acceptor, that emits the energy that can be read and measured. The experimental design used a recombinant protein consisting of a donor and an acceptor fluorescent proteins separated by the SAE2 domain that is targeted by a proteolytic activity (donor-SAE2-acceptor). Consequently, if a protease cleaves that SAE2 domain, donor and acceptor will be split, and FRET will not take place. After several trials, the set-up of the FRET assay was not possible, and a new strategy was developed based in non-denaturing gel electrophoresis. Using this method, it could be observed the presence of SAE2 processing activity in protein extracts from siliques. Despite this positive result observed in the gel and its potential, this technique requires further improvement.