Real-time imaging of cell mineralization

Abstract

A calcificação ectópica tem-se revelado um problema emergente na área da saúde devido à sua correlação com várias doenças, como a doença renal crónica (DRC), hipertensão, diabetes mellitus (DM), doença cardiovascular aterotrombótica e envelhecimento. Este tipo de calcificação está associado principalmente à deposição anormal de complexos de sais de cálcio e fosfato– hidroxiapatite – em células do músculo liso nos vasos sanguíneos. Estudos atuais têm revelado o papel de proteínas plasmáticas que poderão inibir a calcificação tal como a fetuína-A. A presente dissertação visa estudar o papel da proteína plasmática – Fetuína-A – na calcificação ectópica, utilizando o dispositivo de aquisição de imagens em tempo real –CELLCYTE – para seguir e avaliar a sequência de eventos biológicos e a cinética celular. Desta forma, uma variante recombinante de fetuína-A com propriedade de fluorescência, mFa-mRuby, foi produzida e estudada, uma vez que esta proteína é caracterizada por se ligar a depósitos minerais intrínsecos da calcificação ectópica. Protocolos como expressão proteica em células de ovário de hamster chinês (CHO), purificação, transfecção de alto rendimento, Western Dot Blot e SDS-PAGE foram realizados para produzir as amostras de fetuína-A em estudo. Para mimetizar a calcificação patológica no corpo humano, cultura de duas linhas celulares de células do músculo liso vasculares (VSMC) – IM1 e IM3 - foram cultivadas assim como células de osteossarcoma (SaOs-2) e cementoblastos (OCCM), para mimetizar mineralização fisiológica. Todas as linhas celulares foram incubadas em meio de cultura ou de calcificação, para avaliar a proliferação celular e a mineralização ao longo de 7 dias, com ou sem adição de fetuína-A ao meio. Os depósitos minerais foram revelados utilizando o protocolo de coloração de fetuína-A e posterior coloração Alizarin Red. Os resultados observados revelaram uma maior taxa de calcificação das VSMC em comparação com os mineralizadores profissionais (SaOs-2 e OCCM) e uma ligeira inibição da calcificação e mineralização das quatro linhas celulares com adição de fetuína-A em ambos os meios de cultura. Em suma o presente trabalho, proporcionou uma base robusta para pesquisas aprofundadas sobre a calcificação ectópica e o papel da fetuína-A, assim como expandir as aplicações médicas desta proteína plasmática promissora.

Ectopic calcification has become an emerging problem in the health field due to its correlation to various diseases such as chronic kidney disease (CKD), hypertension, diabetes mellitus (DM), atherothrombotic cardiovascular disease, and aging. This type of calcification is associated mainly with the abnormal deposition of calcium and phosphate complexes– hydroxyapatite – onto smooth muscle cells in blood vessels. Current studies rely on the comprehension of the role of proteins that can play a role in inhibiting calcification, such as mineral chaperones like fetuin-A. Therefore, this thesis aims to study the role of plasma protein - fetuin-A - in ectopic calcification, by using the real-time acquisition imaging device CELLCYTE, to follow and evaluate the sequence of biological events and cell kinetics. Therefore, recombinant fluorescent Fetuin-A probe, mFa-mRuby, was produced and studied, as Fetuin-A is known to bind to calcium phosphates. Protocols like protein expression in Chinese hamster ovary cells (CHO), purification, high-yield transfection, Western Dot Blot and SDS-PAGE were performed to produce the fetuin-A probes. To mimic the pathologic calcification in the human body, two cell lines of vascular smooth muscle cells (VSMC) were cultured (IM1 and IM3). To mimic physiological mineralization osteosarcoma cells (SaOs-2) and cementoblasts (OCCM) were cultured. All cell lines were incubated in a culture or calcification medium to assess cell proliferation and mineralization throughout a 7-day study, with or without fetuin-A addition to the medium. Mineral deposits were revealed by using fetuin-A staining protocol and Alizarin red staining. Those results revealed a higher calcification rate of the VSMC in comparison to the professional mineralizers (SaOs-2 and OCCM) and a slight inhibition of calcification and mineralization of the four cell lines with both mediums with the addition of Fetuin-A. In conclusion the present work, provided a robust foundation for in-depth research on ectopic calcification and the role of fetuin-A, as well as expand the medical application of these promising plasma protein.