microRNAs in Cancer: biological effects of microRNAs in colorectal cancer

Abstract

Non-coding RNAs are a class of RNA transcripts that do not codify for protein. Included in this class are the microRNAs, small RNAs with approximately 20 nucleotides in length. microRNAs act post-transcriptionally by binding to 5´- ultraconserved regions, coding regions or 3´-ultraconserved regions of messenger RNAs and inhibit its translation or cause messenger RNA cleavage. Additionally, microRNAs can also bind to pseudogenes and are involved in RNA decoy functions. A single microRNA can bind to several RNAs and a single RNA can be targeted by different microRNAs. Therefore, microRNAs constitute master regulators of gene expression and major key players in the control of cellular functions. microRNAs are deregulated in all tumor types and can act as tumor suppressors or as oncogenes in a tissue- and cell-specific manner. microRNAs control biological mechanisms essential for cancer cells, such as proliferation, cell death, cell cycle, metabolism, hypoxia, angiogenesis, inflammation, migration, invasion, metastasis and cancer stem cells self-renewal. Besides microRNAs´ importance as diagnostic and prognostic tools in cancer, and due to their involvement in cancer biology, microRNAs have been regarded as new therapeutic targets. This thesis focuses on the role of microRNAs on colorectal cancer. Despite the great improvement in therapeutics, colorectal cancer is still one of the most commonly diagnosed tumor types and a frequent cause of cancer-related death. We intend to understand the biological effects of miR-28 in this tumor type. To achieve this goal both in vitro and in vivo approaches were used. In the microRNA biogenesis pathway, usually a primary-microRNA is processed into a precursor-microRNA, which originates a single mature microRNA. However, in some cases, two mature miRNAs are processed. This occurs with the precursor-miR-28 that is processed into two mature microRNAs that were named miR-28-5p and miR-28- 3p. We identified for the first time that both mature forms of miR-28 were deregulated in colorectal cancer. Contrary to some tumor and cell types in which miR-28 was found to be upregulated, in colorectal cancer miR-28 is downregulated in tumor compared with normal colorectal tissue. However, the two mature forms have distinct functions. Our in vitro results revealed that miR-28-5p overexpression decreased proliferation, increased apoptosis, caused a G1-arrest in the cell cycle, and decreased migration and invasion, while miR-28-3p overexpression had no effect on proliferation but increased migration and invasion. This was the first description of miR-28 dual role in colorectal cancer cells. As miR-28 mature forms are transcribed together, we analyzed the overall result in vivo. Xenografts of colorectal cancer cells overexpressing miR-28 caused a slower tumor growth in mice, while increased metastasis, when compared with the control group. In this thesis we also discuss the strategies to inhibit or restore microRNAs function. The dual role of miR-28 has great impact on the design of therapies using microRNAs, in particular for upregulation of microRNA levels using expression vectors. Variation in expression levels of microRNAs has a tremendous impact on the intracellular signaling networks. We determined that miR-28-5p targets Cyclin D1, an important regulator of cell cycle progression, in particular of the G1-S phase transition. Additionally, miR-28-5p directly targets HOXB3, a transcription factor described to be upregulated in colon cancer. On the other hand, miR-28-3p directly regulates the expression of NM23-H1, an anti-metastatic gene. miR-28 is part of an extensive number of microRNAs deregulated in colorectal cancer. It is essential to understand the effect of the microRNAs in cancer to be able to interfere with the tumor biology and consequently generate therapeutic strategies based on microRNAs as an approach to fight cancer.

RNAs não codificantes são uma classe de transcritos de RNA que não codificam proteína. Dentro desta classe encontram-se os microRNAs, pequenos RNAs com 20 nucleótidos de comprimento. Os microRNAs actuam após a transcrição e ligam-se por complementariedade de bases a RNAs mensageiros, nas suas regiões 5´- ou 3´-ultraconversadas e nas regiões codificantes. Os microRNAs inibem a tradução ou causam a degradação do RNA mensageiro. Além disso, os microRNAs podem também ligar-se a pseudo-genes e estar envolvidos em funções de RNA “decoy”. Um único microRNA pode ligar-se a vários RNAs, e um único RNA pode ser o alvo de vários microRNAs. Assim sendo, os microRNAs constituem excelentes reguladores da expressão genética e são elementos chave no controlo das funções celulares. Os microRNAs estão desregulados em todos os tipos de tumor e podem actuar como supressores tumorais ou como oncogenes, dependendo do tipo de tecido e de célula. Os microRNAs controlam mecanismos biológicos essenciais para as células neoplásicas, incluindo a proliferação, a morte e o ciclo celular, o metabolismo, a hipoxia, a angiogénese, a inflamação, a migração, a invasão, a metastização e a autorenovação das células estaminais tumorais. Para além da importância dos microRNAs como ferramentas de diagnóstico e prognóstico oncológico, e devido ao seu envolvimento na biologia tumoral, os microRNAs têm sido apresentados como novos alvos terapêuticos. Esta tese analisa o papel dos microRNAs no cancro colorectal. Apesar dos significativos avanços terapêuticos, o cancro colorectal continua a ser um dos tipos tumorais mais diagnosticados e uma frequente causa de morte por cancro. No trabalho aqui apresentado, pretende-se analisar o efeito biológico do miR-28 neste tipo tumoral. Para atingir este objectivo utilizámos ferramentas in vitro e in vivo.Geralmente, na via da biogénese dos microRNAs, um microRNA-primário é processado constituindo o microRNA-precursor que, por sua vez, origina um único microRNA maduro. No entanto, em alguns casos, são originados dois microRNAs maduros. Esta situação ocorre com o precursor do miR-28 que é processado em dois microRNAs maduros designados de miR-28-5p e miR-28-3p. Identificámos, pela primeira vez, ambas as formas do miR-28 maduro como estando desreguladas em cancro colorectal. Contrariamente a outros tipos de tumores/células nas quais o miR- 28 está sobreexpresso, no cancro colorectal o miR-28 está subexpresso no tumor quando comparado com os seus níveis de expressão no tecido colorectal normal. No entanto, as duas formas maduras têm funções distintas. Os estudos in vitro revelaram que a sobreexpressão do miR-28-5p diminui a proliferação, aumenta a apoptose, impede a progressão do ciclo celular na fase G1, e diminui a migração e a invasão; enquanto que a sobreexpressão do miR-28-3p não tem efeito na proliferação mas aumenta a migração e a invasão. Esta é a primeira descrição do duplo papel do miR-28 em neoplasia colorectal. Visto que as formas maduras do miR-28 são transcritas conjuntamente, analisámos o resultado global da expressão do miR-28 in vivo. A injecção, em murganhos, de células neoplásicas colorectais que sobreexpressam miR- 28 causou um crescimento mais lento dos tumores, mas provocou um aumento no número de metastases, quando comparámos com o grupo control. Nesta tese, discutimos as estratégias para inibir ou restaurar a função dos microRNAs. O duplo papel do miR-28 tem um vasto impacto no desenho de terapias que recorram a microRNAs, em particular na sobreexpressão dos níveis de microRNAs usando vectores de expressão. A variação dos níveis de microRNAs tem um impacto tremendo na rede de sinalização intracellular. Observámos que o miR-28-5p tem como alvo a Cyclin D1, um importante regulador da progressão no ciclo celular, em particular na transição G1-S. Além disso, o miR-28-5p tem como alvo directo o HOXB3, um factor de transcrição descrito como estando sobreexpresso no cancro do colon. Por outro lado, o miR-28-3p regula directamente a expressão de NM23-H1, um gene anti-metastático. O miR-28 faz parte de um extenso número de microRNAs que está desregulado em neoplasias. Compreender o efeito dos microRNAs no cancro é essencial para interferir com a sua biologia e, consequentemente, gerar estratégias terapêuticas utilizando microRNAs na luta contra esta doença devastadora.