Sondas fluorescentes e agentes antifúngicos derivados do Nile Blue

Abstract

Atendendo ao conhecido interesse a nível biológico das sulfonamidas e de benzo[a]fenoxazinas, assim como à experiência do grupo de trabalho nesta última família de compostos, decidiu-se efetuar a síntese de uma nova série de benzo[a]fenoxazinas, derivadas do Nile Blue, possuindo um grupo sulfonamida como substituinte no sistema policíclico. A escolha deste grupo como substituinte teve como base trabalho publicado anteriormente que mostrou que uma benzo[a]fenoxazina com o grupo metilfenilsulfonamido na amina da posição 5 apresentava um interessante potencial antifúngico (MIC 30 μM em S. cerevisiae). A inexistência de outros derivados semelhantes motivou a exploração de diferentes combinações deste grupo com outros substituintes para otimização da atividade desta classe de compostos. Por outro lado, benzo[a]fenoxazinas possuindo nas aminas das posições 5 e 9 diferentes combinações de substituintes apresentam propriedades fotofísicas que permitem a sua aplicação como sondas de fluorescência na região do infravermelho próximo, designadamente em meio biológico, pelo que se torna fundamental conhecer o comportamento destes compostos em meio aquoso, especificamente em condições fisiológicas simuladas. Assim, neste trabalho efetuou-se a síntese de seis novas benzo[a]fenoxazinas possuindo como substituintes na amina da posição 5 um grupo sulfonamida e na amina da posição 9 grupos propilo (um ou dois), ou um grupo etilo em simultâneo com um grupo metilo na posição 10 do sistema policíclico para comparação de resultados. Para além disso, foram também sintetizadas as benzo[a]fenoxazinas análogas às anteriores, com o mesmo tipo de substituição na posição 9 mas sem o grupo sulfonamida na posição 5, apenas com o grupo amina (sem substituintes), ou com o grupo (3-aminopropil)amino para avaliação do efeito do grupo sulfonamida na atividade biológica. A caracterização dos compostos sintetizados foi efetuada pelas técnicas espectroscópicas de IV, RMN de 1H e 13C. Foram avaliadas as propriedades fotofísicas dos cloretos de benzo[a]fenoxazínio obtidos pelas técnicas de espectroscopia de UV/Vis e de fluorescência, tendo sido obtidos os espetros de absorção e emissão de fluorescência em etanol, água e a diferentes valores de pH, designadamente 3, 5, 7,4 e 8,5, relevantes a nível fisiológico. A atividade antiproliferativa dos cloretos de benzo[a]fenoxazínio sintetizados foi determinada na levedura Saccharomyces cerevisiae PYCC 4072, utilizando o método de microdiluição descrito para os testes de suscetibilidade antifúngica em leveduras.

Considering the known biological interest of sulfonamides and benzo[a]phenoxazines, as well as the experience of the research group in the latter family of compounds, it was decided to synthesize a new series of benzo[a]phenoxazines, Nile Blue derivatives, having a sulfonamide as a substituent in the polycyclic system. The choice of this group was based on previous work showing that a benzo[a]phenoxazine with methylphenylsulfonamido at 5-position displayed an interesting antifungal activity (MIC 30 μm in S. cerevisiae). However, the lack of comparative results motivated the exploitation of different combinations of this group with other substituents for optimization of the activity of this class of compounds. On the other hand, benzo[a]phenoxazines possessing in the 5- and 9- amine positions different combinations of substituents show photophysical properties that allow its application as fluorescence probes in the region of near infrared, namely in biological environment, becoming extremely important to know the behavior of these compounds in aqueous medium, specifically at simulated physiological conditions. Thus, in this work is presented the synthesis of six new benzo[a]phenoxazines having as substituent at the 5-position a sulfonamide group and at the 9-position propyl groups (one or two), or an ethyl group with a methyl group at 10-position of the polycyclic system for the comparison of results. In addition, benzo[a]phenoxazines analogous to the above were also synthesized with the same type of substitution at the 9-position but without sulfonamide group at the 5-position, with only amine group (without substituents), or with (3-aminopropyl)amino group to evaluate the effect of sulfonamide group on biological activity. Full characterization of all compounds was carried out by IR, 1H and 13C NMR spectroscopy. Photophysical properties of synthesized benzo[a]phenoxazinium chlorides were evaluated by UV/Vis and fluorescence spectroscopy. Absorption and fluorescence emission spectra were obtained in ethanol, water, and at different physiologically relevant pH values, namely 3, 5, 7.4 and 8.5. The antiproliferative activity of the synthesized benzo[a]phenoxazinium chlorides was determined using Saccharomyces cerevisiae PYCC 4072 and the microdilution method described for antifungal susceptibility tests in yeast.